《Microorganisms》：Nasopharyngeal Microbiome Profiles of SARS-CoV-2 RT-PCR Positive and Negative Outpatients in Guayaquil, Ecuador
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鼻咽微生物组（nasopharyngeal microbiome）是呼吸道健康的重要贡献者，并可能影响宿主对包括SARS-CoV-2在内的呼吸道病毒感染的应答，但其与病毒检出之间的关联仍未完全阐明，尤其在拉丁美洲的门诊人群中。本横断面研究连续招募了2021年6
鼻咽微生物组（nasopharyngeal microbiome）是呼吸道健康的重要贡献者，并可能影响宿主对包括SARS-CoV-2在内的呼吸道病毒感染的应答，但其与病毒检出之间的关联仍未完全阐明，尤其在拉丁美洲的门诊人群中。本横断面研究连续招募了2021年6月2日至7日期间在厄瓜多尔瓜亚基尔接受SARS-CoV-2逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）检测的成年门诊患者，并采用16S rRNA基因（16S ribosomal RNA gene）V3–V4可变区测序对其鼻咽微生物组进行表征。研究比较了RT-PCR阳性（n = 41）与RT-PCR阴性（n = 17）个体之间的微生物组多样性、分类组成（taxonomic composition）、差异丰度（differential abundance）及预测功能谱（predicted functional profiles）。在分类学分析中，经分类群过滤后共纳入57份样本（41份RT-PCR阳性与16份RT-PCR阴性）。RT-PCR状态与α多样性（alpha diversity）或β多样性（beta diversity）均无关联，亦无任何分类群或预测通路呈现差异丰度；在考虑采集日期后，α与β多样性结果保持不变。两组均表现出相似的微生物群落，以Corynebacterium sp.与Staphylococcus sp.为优势菌，二者与Cutibacterium sp.共同构成核心微生物组（core microbiome）。这些研究结果表明，在厄瓜多尔这一门诊队列中，SARS-CoV-2的检出与鼻咽微生物组分类组成或预测功能谱的重大改变均无关联，但鉴于RT-PCR阴性组样本量较小，仍不能排除较小效应的存在。
研究背景
鼻咽微生物组是上呼吸道微生物群落的关键组成部分，作为黏膜免疫调节因子、抵御病原体定植的屏障及上皮稳态的维持者而发挥保护作用。既往研究表明，流感病毒、呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）与鼻病毒等呼吸道感染可改变上呼吸道微生物群落组成并促进细菌继发感染，据此推测SARS-CoV-2可能经激活炎症通路、破坏上皮屏障、改变pH与营养可利用性以及药物与抗生素使用的间接效应引发类似改变。然而相关研究结论不一：部分仅报告属级分类群的轻微变化或多样性适度下降，部分未发现阳性者与阴性者在丰富度、多样性或群落结构上的差异，而住院或重症患者队列多报道多样性下降、共生分类群减少及机会致病菌富集，上述差异可能源于临床严重程度、采样时机、测序方法与抗生素暴露的不同。拉丁美洲本地化数据匮乏，而全球多数SARS-CoV-2感染发生于轻症或非重症门诊患者，故针对中等收入国家成年门诊人群的研究尤为不足。基于上述证据，研究人员假设门诊成年人鼻咽微生物群落不会因SARS-CoV-2 RT-PCR检测状态而呈现明显不同。
研究开展、结论与意义
研究人员开展了横断面研究，于2021年6月2日至7日在厄瓜多尔瓜亚基尔一处门诊SARS-CoV-2检测点连续招募接受逆转录聚合酶链反应（reverse transcription PCR，RT-PCR）检测的成年门诊患者，采集单一鼻咽拭子并在获知检测结果后以同一拭子进行微生物组分析。研究采用16S rRNA基因（V3–V4区）测序表征鼻咽微生物组，比较RT-PCR阳性（n = 41）与阴性（n = 17）个体在多样性、分类组成、差异丰度及预测功能谱上的差异，并开展采集日期敏感性分析，得出RT-PCR状态与α多样性、β多样性均无显著关联，无任何分类群或预测通路在错误发现率（false discovery rate，FDR）校正后差异丰度的结论；鉴于阴性组样本量较小，不能排除较小效应。该研究为拉丁美洲门诊人群补充了基线数据，提示轻症感染状态下鼻咽微生物组呈“早期弹性”特征，并提示未来需采用纵向设计与直接宏基因组或宏转录组测序。
关键技术方法概括
主要包括：以DADA2流程推断扩增序列变体（ASV）并基于SILVA数据库注释；以系统发育树计算Faith's系统发育多样性（Faith's PD）与UniFrac距离；α多样性采用Shannon、Simpson、Chao1指数，β多样性采用Bray–Curtis、Jaccard及加权/非加权UniFrac距离并结合主坐标分析与置换多元方差分析；差异丰度采用DESeq2分析，功能预测采用PICRUSt2推断MetaCyc通路；样本来自瓜亚基尔门诊SARS-CoV-2检测点。
研究结果
队列与测序：59份样本中58份通过质控（17份阴性、41份阳性；年龄19–99岁，两组差异无统计学意义，p = 0.51），采集日期与RT-PCR状态强关联（2021年6月2日采集的36份样本中35份为阳性，p < 0.001）；测序深度中位数5780条Reads/样本，质控数据集保留87个种级分类群，经分类群过滤后17个种级分类群与57份样本进入组成分析。
α与β多样性：两组样本内多样性无差异（Shannon指数p = 0.68；Simpson指数p = 0.62；Chao1 p = 0.23；观测丰富度p = 0.23；Faith's PD p = 0.46），性别间亦无差异；置换多元方差分析显示四种距离指标下RT-PCR状态与群落结构均无关联（Bray–Curtis p = 0.31；Jaccard p = 0.26；加权UniFrac p = 0.13；非加权UniFrac p = 0.12），多变量离散度亦无组间差异（betadisper，p = 0.14–0.93）；年龄分层与采集日期敏感性分析结论一致。
分类组成与差异丰度：两组菌群结构相似，均以Corynebacterium sp.（69.6%对54.9%）与Staphylococcus sp.（13.2%对22.0%）为优势菌属；DESeq2在13个属级与17个种级分类群中均未发现FDR < 0.05的差异类群。
功能推断与核心微生物组：PICRUSt2共推断408条MetaCyc通路，FDR校正后RT-PCR与性别均无差异通路；总体通路组成（置换多元方差分析，R
2 = 0.020，p = 0.29）与离散度（p = 0.65）亦无组间差异；核心微生物组由Corynebacterium sp.（93.0%）、Staphylococcus sp.（82.5%）与Cutibacterium sp.（56.1%）构成且两组相同；Anoxybacillus sp.未达核心标准，其检出率（48.8%对35.3%，p = 0.40）与相对丰度（p = 0.33）均无组间差异。
讨论
研究人员指出，RT-PCR状态对群落结构变异的解释至多为3.4%（置换多元方差分析R
2），个体间变异占主导；UniFrac指标效应量相对最大但不显著，可能反映优势菌属内相关谱系的细微变化，但因统计学效力不足应谨慎解读。结果与既往报道轻症状态下上呼吸道微生物组稳定的研究一致，而与住院或危重患者队列形成对比，提示微生物组扰动可能更紧密地与临床背景及宿主状态相关，而非SARS-CoV-2的单纯检出。Corynebacterium sp.在两组中均为优势菌属，其相对丰度存在地域差异（荟萃分析中南美洲样本高于其他大洲），其高丰度可能反映瓜亚基尔沿海热带地区的环境条件，跨安第斯高地与沿海城市的比较值得探索。研究局限性包括：横断面设计无法评估时间动态；便利抽样且样本量未预设，在17例阴性、41例阳性样本量下仅具备检出Cohen's d ≥ 0.82的效能，故不能将“无显著差异”等同于等效；单中心且民族信息缺失；未收集抗生素使用史；采集日期与RT-PCR状态强关联限制二者效应分离；16S rRNA基因（V3–V4）测序分辨率低于属级。各分析层面结果一致，增强了结论稳健性。
结论（翻译）
研究人员总结认为，在瓜亚基尔成年门诊人群中，SARS-CoV-2 RT-PCR状态与鼻咽微生物组多样性、分类组成或预测功能谱的可检测差异均无关联，α与β多样性结果在采集日期敏感性分析中保持不变；鉴于RT-PCR阴性组样本量较小，较小差异不能排除；未来需开展具备详细临床元数据并结合直接宏基因组或宏转录组测序的纵向研究，以明确SARS-CoV-2感染与鼻咽微生物组扰动相关的条件。
