脱氧胆酸接枝羧甲基壳聚糖纳米胶束嵌入海藻酸盐微球用于实验性结肠炎口服芒果苷递送

《International Journal of Nanomedicine》：Deoxycholic Acid-Grafted Carboxymethyl Chitosan Nanomicelles Embedded in Alginate Microspheres for Oral Mangiferin Delivery in Experimental Colitis

目的：构建一种层级多糖制剂，将疏水性芒果苷（MGF）的纳米级载药与微尺度胃肠道保护相结合，并在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎中进行评价。方法：将脱氧胆酸（DA）接枝于羧甲基壳聚糖（CMCS）后与MGF自组装形成纳米胶束（MGF/DA–CMCS SNM），并通过电喷雾将其嵌入Ca²⁺交联的海藻酸盐微球中（MGF/DA–CMCSat SA MS）。通过理化表征、序贯pH释放与胃肠道稳定性、载体荧光成像、细胞实验、DSS概念验证模型、16S rRNA与RNA测序以及短期相容性试验进行评估。结果：纳米胶束粒径为120.7 ± 0.9 nm，PDI为0.342 ± 0.019，zeta电位为?24.2 ± 1.0 mV，表观包封率为88.03% ± 0.58%；微球粒径为110.3 ± 2.6 μm。海藻酸盐包封抑制了pH 1.2条件下的释放并加速了肠道pH条件下的释放，与微球在模拟胃液中保持完整、在肠液中崩解相一致。体外实验中，该体系可清除自由基、降低细胞内ROS、保护细胞免受氧化损伤并减弱炎症性巨噬细胞活化。口服给药后，Cy5标记微球的肠道荧光强于单独纳米胶束；由于Cy5标记的是载体，该结果反映载体分布而非组织MGF浓度。在DSS结肠炎中，该体系减轻了体重下降、DAI、结肠缩短和组织学损伤，并与上皮屏障标志物变化以及微生物群和转录组改变相关，且具有短期体外和体内相容性。结论：纳米胶束嵌入微球体系为MGF提供了肠道pH响应性口服递送的概念验证。直接的药代动力学测定、仅载体对照、形态计量组织病理学、机制验证、更长期安全性测试以及工艺放大表征仍有必要。

研究背景：炎症性肠病（IBD）包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一种由遗传易感性、环境触发因素、肠道微生物群和失调的黏膜免疫相互作用引起的慢性复发性胃肠道炎症。除持续性炎症外，氧化应激、免疫失调和上皮屏障破坏现已被认为是维持黏膜损伤和驱动疾病进展的相互关联特征。口服给药是管理肠道炎症的首选途径，因其无创且支持患者依从性，但有效递送至炎症结肠须克服一系列生理屏障：摄入后生物活性化合物须耐受胃酸、在上消化道转运中抵抗过早释放、承受腔内稀释和黏液截留，并在炎症黏膜部位实现足够滞留。疏水性植物化学物还面临额外的上游屏障：其低水溶性限制了递送开始前可载入和分散的剂量。因此，有效的口服平台须依次解决这些屏障——疏水性载药、胃保护、肠道释放和黏膜沉积——而非孤立地解决其中任何一个。芒果苷（MGF）是一种天然存在的C-葡萄糖基呫吨酮，已在生物材料递送系统和肠道微生物代谢研究中被探讨。既往研究考察了自组装甜菊糖苷A纳米胶束提高MGF口服生物利用度以及MGF封装纳米颗粒的体外细胞保护和抗诱变活性。壳聚糖/海藻酸盐/钙水凝胶珠也已被研究用于口服肽递送，而含姜黄素-硒纳米颗粒的海藻酸盐珠则说明了利用微尺度基质包载纳米级货物。DA修饰的壳聚糖衍生物已被研究用于其他疏水性药物的递送。在此背景下，本研究将DA–CMCS介导的MGF结合与海藻酸盐基质结合于一个递送单元中。CMCS是一种有吸引力的起始材料，因其具有生物相容性、水分散性和化学可修饰性。然而其高亲水性使其无法形成稳定疏水结构域以结合和携带疏水性药物，因此天然CMCS不适合封装MGF等化合物。将脱氧胆酸（DA）——一种胆汁酸衍生的疏水物——接枝到CMCS骨架上，引入驱动自组装成能够容纳MGF的纳米胶束的疏水结构域，同时保留载体的多糖特性。Ca²⁺交联的海藻酸钠则形成pH响应性微尺度基质，在胃酸条件下稳定并在肠道pH下崩解，提供纳米胶束单独无法保证的胃保护和肠道触发释放。因此，将两者结合可在单一载体内将纳米级疏水载药与微尺度胃肠道保护配对。本研究构建并评价一种用于DSS诱导实验性结肠炎中MGF口服递送的层级多糖基纳米胶束嵌入微球体系。该设计贡献三个要素：（i）将亲水性CMCS转化为两亲性DA–CMCS，以实现纳米级自组装和疏水性MGF的封装；（ii）将预形成的MGF/DA–CMCS纳米胶束嵌入Ca²⁺交联的海藻酸盐微球中，在一个递送单元中结合纳米级载药与微尺度胃肠道保护；（iii）跨结构–递送–功能层面评价该体系，涵盖大分子表征、序贯pH释放与胃肠道稳定性、体内荧光分布、基于细胞的抗氧化和巨噬细胞实验、DSS实验性结肠炎模型以及支持性微生物群、转录组和短期相容性读数。DSS模型提供制剂相关生物学活性的概念验证证据，但不确立临床疗效或直接证明MGF生物利用度改善。

研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员构建了DA–CMCS接枝共聚物，通过¹H NMR、FTIR和TNBS法确认DA成功接枝（接枝度6.56%）；制备了MGF/DA–CMCS SNM（粒径120.7 ± 0.9 nm，表观包封率88.03% ± 0.58%）并通过电喷雾嵌入海藻酸盐微球（粒径110.3 ± 2.6 μm，嵌入步骤包封率99.39% ± 0.37%）。序贯pH释放实验表明微球在pH 1.2下抑制释放（2 h仅20.62% ± 1.07%），在肠道pH下加速释放（pH 7.4时8 h达96.65% ± 1.03%），与微球在模拟胃液中保持完整、在模拟肠液中崩解一致。Cy5标记微球在结肠炎小鼠中产生强于单独纳米胶束的肠道荧光。体外实验表明该体系清除DPPH和ABTS自由基、降低LPS刺激RAW 264.7细胞内ROS、保护细胞免受H₂O₂氧化损伤、降低M1相关介质（MPO、NO、TNF-α、IL-6、IL-1β）并升高IL-10，同时降低CD86相关、升高CD206相关荧光强度。在DSS结肠炎模型中，该体系减轻体重下降、降低DAI、减轻结肠缩短和组织学损伤（组织学评分3.73 ± 0.42 vs DSS组9.40 ± 0.20），降低MPO和MDA、升高SOD，降低促炎因子并升高IL-10，升高ZO-1和occludin荧光强度，降低iNOS相关并升高CD206相关信号。16S rRNA测序显示该体系与微生物群组成改变相关，包括Akkermansia、Parabacteroides和Lactococcus相对丰度升高以及Escherichia-Shigella和Bacteroides相对丰度降低；RNA测序显示转录组向对照组偏移，差异表达基因富集于细胞因子–受体相互作用、T辅助细胞相关、PI3K–Akt和NF-κB通路。短期相容性实验显示溶血率低于5%，Caco-2和RAW 264.7细胞活力在100 μg/mL下保持80%以上，7天口服给药后AST、ALT、CREA和BUN与对照组无显著差异，主要器官H&E未见明显异常。该研究的意义在于为MGF提供了一种肠道pH响应性口服递送的概念验证策略，将纳米级疏水载药与微尺度胃肠道保护整合于单一多糖基载体中。

关键技术方法：研究人员通过EDC/NHS介导的偶联反应合成DA–CMCS，采用透析和冻干纯化；通过滴加-搅拌-冰浴超声-旋蒸法制备MGF/DA–CMCS SNM；采用电喷雾模式（25G针头、流速1 mL/min、电压18.4 kV、接收距离30 cm）将纳米胶束分散于海藻酸钠注射相并滴入CaCl₂接收相形成微球；通过HPLC测定MGF含量和包封率；采用DLS测定粒径、PDI和zeta电位，TEM观察形态，FTIR、DSC和XRD进行理化表征；通过透析法在模拟胃液（pH 1.2）、模拟肠液（pH 6.8）和模拟结肠液（pH 7.4）中序贯评价释放；采用C57BL/6J小鼠3%（w/v）DSS饮水5天建立结肠炎模型，第3–7天每日灌胃给药（MGF等效剂量50.0 mg/kg/day），第8天采集样本；通过16S rRNA基因V3–V4区测序和结肠组织RNA测序进行分析。样本队列来源：C57BL/6J雄性小鼠（6–8周龄）购自河南斯克贝斯生物科技有限公司，RAW 264.7巨噬细胞购自Servicebio，Caco-2细胞购自Procell。

研究结果：

DA–CMCS的合成与大分子表征：通过¹H NMR观察到DA–CMCS在0.5–2.3 ppm出现DA特征脂肪族共振（三个DA甲基信号位于约0.6–1.0 ppm），FTIR显示约2935和2830 cm^?1的C–H伸缩带，TNBS法测定DA接枝度为6.56%，证实DA成功共价接枝于CMCS。GPC/SEC显示DA–CMCS的Mn和Mw降低但Mz和Mz+1升高、分散度增加，表明表观分子量分布重新分布而非所有聚合物链均匀降低。

MGF/DA–CMCS纳米胶束的自组装及其在海藻酸盐微球中的封装：TEM显示纳米胶束近似球形，三批样品平均流体力学直径为120.7 ± 0.9 nm、PDI为0.342 ± 0.019、zeta电位为?24.2 ± 1.0 mV、表观包封率为88.03% ± 0.58%、载药量为46.82% ± 0.31%。电喷雾嵌入后微球直径为110.3 ± 2.6 μm、载药量为4.70 ± 0.14%、嵌入步骤包封率为99.39% ± 0.37%。XRD显示MGF的尖锐结晶反射在纳米胶束中基本消失，DSC显示SNM和MS中约260 °C处无可检测的MGF熔融事件，提示MGF以非晶态分散于载体中。

海藻酸盐包封控制序贯pH响应性与胃肠道崩解：游离MGF在酸性条件下快速释放（1 h为78.63% ± 0.91%，2 h为85.37% ± 1.09%），SNM释放较慢（1 h为46.52% ± 0.56%，2 h为52.45% ± 0.96%），而MGF/DA–CMCSat SA MS显著抑制胃相过早释放（1 h为10.32% ± 1.33%，2 h为20.62% ± 1.07%），pH 6.8时6 h释放增至56.50% ± 1.03%，pH 7.4时8 h达96.65% ± 1.03%、12 h达98.68% ± 1.35%。光学显微镜显示微球在模拟胃液中3 h内保持大小和球形结构，在模拟肠液中立即收缩失去球形，1.5 h内大部分结构崩解，3 h内近完全溶解。释放机制从胃相的扩散限制转变为肠道pH下的溶胀和侵蚀控制。

MGF/DA–CMCSat SA MS增加口服后载体相关肠道荧光：Cy5标记微球在12 h内产生强肠道荧光信号，12 h时结肠炎小鼠肠道荧光强度显著高于健康小鼠，提示标记载体在炎症肠道中滞留或沉积增强；Cy5标记SNM在2–12 h呈先升后降曲线，6 h达峰后12 h衰减。由于Cy5标记DA–CMCS而非MGF，该结果不量化MGF递送、组织浓度、穿透或药代动力学暴露。

MGF/DA–CMCSat SA MS保留抗氧化活性并减少氧化性细胞损伤：两种制剂均以浓度依赖方式清除DPPH和ABTS自由基，MGF浓度达10 μg/mL时最大清除率分别超过75%（DPPH）和85%（ABTS）。H₂O₂暴露后RAW 264.7细胞活力经MGF/DA–CMCSat SA MS处理从48.51%增至77.21%。DCFH-DA标记显示MGF/DA–CMCSat SA MS处理组荧光积累低于LPS组，流式细胞术进一步证实细胞内ROS相关荧光强度降低。

MGF/DA–CMCSat SA MS在体外改变炎症介质和巨噬细胞相关表面标志物：与LPS组相比，SNM和MS组M1相关促炎介质（MPO、NO、TNF-α、IL-6、IL-1β）水平显著降低（P ≤ 0.01），抗炎细胞因子IL-10水平显著升高（P ≤ 0.01）。流式细胞术显示两种制剂处理后CD86相关荧光强度低于LPS组、CD206相关荧光强度高于LPS组，与细胞因子数据一致。MS组CD86相关荧光强度低于LPS组但高于IL-4 + IL-13组，CD206相关荧光强度高于LPS组但低于IL-4 + IL-13组。由于标志物强度变化也可反映巨噬细胞群体组成差异，该数据支持治疗相关的M1/M2相关标志物变化，但不独立确立明确的巨噬细胞极化。

口服MGF/DA–CMCSat SA MS减轻DSS诱导的结肠炎表型：在第8天预设终点，DSS组DAI为8.0 ± 1.3，SASP组为4.6 ± 1.02（P ≤ 0.001），MS治疗与较轻体重下降和较低DAI相关，并减轻DSS相关结肠缩短（P ≤ 0.001）。与DSS组相比，MS组MPO（P ≤ 0.05）和MDA（P ≤ 0.001）降低、SOD活性升高（P ≤ 0.05）、TNF-α（P ≤ 0.001）、IL-6（P ≤ 0.001）和IL-1β（P ≤ 0.001）降低、IL-10升高（P ≤ 0.001）。H&E描述性检查显示DSS组出现隐窝丢失、表面不规则和炎症细胞浸润，MS处理后这些特征减轻。盲法半定量组织学评分（范围0–11）显示空白对照组为1.13 ± 0.31、DSS组为9.40 ± 0.20、游离MGF组为8.53 ± 0.23、SNM组为6.00 ± 0.40、MS组为3.73 ± 0.42、SASP组为4.47 ± 0.23；MS组显著低于DSS组（P ≤ 0.001）和SNM组（P ≤ 0.01），与SASP组无显著差异（P = 0.056），但仍高于空白对照组（P ≤ 0.001）。

MGF/DA–CMCSat SA MS与上皮屏障标志物变化和结肠巨噬细胞标志物改变相关：免疫荧光显示MS处理与较高的ZO-1（P ≤ 0.05）和occludin（P ≤ 0.001）荧光强度相关，上皮沿线可见连接相关染色；SASP处理后occludin相关荧光低于MS组（P ≤ 0.05）；MS组两种标志物荧光强度与健康对照组无显著差异（P > 0.05）。F4/80与iNOS或CD206共标记显示DSS处理与黏膜和固有层较高iNOS相关信号相关，与DSS组相比MS组iNOS相关信号较低、CD206相关信号较高。

MGF/DA–CMCSat SA MS与微生物群和转录组向结肠恢复的偏移相关：16S rRNA基因测序显示组间群落结构差异，Venn分析揭示组特异性分类群且重叠极少。DSS组α多样性指数（ACE、Chao1、Sobs、Shannon）显著低于NC和DSS–MS组，提示MS治疗与丰富度和多样性增加相关；Simpson指数显示DSS–MS组均匀度显著高于NC和DSS组。探索性PCA和PCoA显示DSS、DSS–MS和NC组间分离。属水平上，DSS–MS组Akkermansia、Parabacteroides和Lactococcus丰度较DSS组升高，而Escherichia-Shigella和Bacteroides等常与菌群失调相关的属相对丰度降低。FAPROTAX分析揭示MS处理后肠道相关功能谱改变，BugBase结果代表预测微生物表型而非属水平丰度测量。RNA测序显示PCA（PC1 + PC2 = 80.1%方差）组间分离，DSS–MS样本较DSS样本更接近对照样本；差异表达分析鉴定DSS–MS与DSS组间1251个基因（526个上调、725个下调）；2111个基因集的MFuzz分析突出Cluster 1、3、7和10，其表达模式在治疗后向对照组偏移；1490个基因的KEGG分析鉴定细胞因子–受体相互作用、T辅助细胞相关、PI3K–Akt和NF-κB通路富集，GO术语包括免疫反应、白细胞活化和细胞表面受体信号传导。由于未进行仅MGF转录组比较和qRT-PCR验证，这些转录组发现为探索性关联而非因果机制证明。

MGF/DA–CMCSat SA MS的体外和短期体内相容性：30 min后各组溶血率低于5%，支持所测条件下的初步血液相容性。24 h后Caco-2和RAW 264.7细胞在100 μg/mL下活力保持80%以上，活/死染色显示50 μg/mL下无明显生长抑制或细胞死亡。7天口服MS后AST、ALT、CREA和BUN与对照值无显著差异，主要器官描述性H&E检查未见明显异常。由于每组仅3只小鼠且暴露7天，这些发现提供初步短期相容性证据，不确立全面或长期安全性。

讨论部分总结：研究人员的生物大分子设计原理将MGF与两亲性DA–CMCS纳米胶束的结合和这些纳米胶束掺入钙交联海藻酸盐基质两种制剂功能相结合。既往MGF递送研究包括甜菊糖苷A纳米胶束和其他纳米颗粒制剂，海藻酸盐基系统提供了pH响应性封装和纳米级货物掺入的相关例子。此处评价的贡献是特定的DA–CMCS/海藻酸盐组合及其在所测模型中的物理化学和生物学行为；观察支持组合两种组分的原理，但不确立优于所有先前MGF递送系统或证明每个给药的纳米胶束在微球内保持完整。关于胃肠道释放行为和载体相关肠道荧光，口服递送至炎症肠道的一个反复出现的问题是疏水性生物活性物在到达远端部位前过早损失；此处序贯pH释放显示MS抑制酸性条件下的早期释放并在向肠道相关pH转变后更快释放MGF，该行为与形态学响应一致。口服给药后Cy5标记微球产生强于单独纳米胶束的肠道荧光，与标记载体在炎症肠道中更大的沉积或滞留一致；Cy5荧光报告载体水平分布而不测量组织MGF浓度，制剂与炎症组织之间静电相互作用的任何贡献仍属推测。这些发现支持胃肠道耐受性和载体相关肠道荧光，而直接基于HPLC或LC–MS的组织暴露测量仍然必要；序贯pH模型不证明结肠特异性释放，体外累积游离MGF释放若无直接暴露测量不能转化为生物利用度结论。关于将递送行为与抗氧化和巨噬细胞相关响应联系，氧化应激是结肠炎的核心特征，因为过量ROS可加重上皮损伤和炎症信号；MS在化学和细胞实验中显示抗氧化活性，包括DPPH和ABTS自由基清除、降低细胞内ROS相关荧光和防止氧化损伤；体内较低的结肠MPO和MDA连同较高的SOD活性与氧化负担降低一致，这些变化伴随较低的促炎介质和较高的IL-10；巨噬细胞相关实验同样显示较低的M1相关和较高的M2相关标志物信号，然而CD86/CD206和iNOS/CD206测量不能区分标志物调节与细胞群体组成变化，因此不独立证明巨噬细胞极化；总之，抗氧化、炎症和巨噬细胞标志物读数与增强的载体相关肠道荧光相关，但不确立从递送到机制的因果通路。关于屏障恢复、微生物群偏移和转录组关联，在IBD中上皮屏障破坏、免疫失调和肠道微生物群失衡是相互关联的过程；MS治疗与较高的ZO-1和occludin相关荧光及较轻的描述性组织学改变相关，与屏障标志物状态改善一致但非量化的组织病理学效应；屏障恢复可能合理减少腔内抗原穿透和炎症放大；同时16S rRNA基因测序显示治疗相关组成差异，包括Akkermansia、Parabacteroides和Lactococcus相对丰度较高以及Escherichia-Shigella和Bacteroides相对丰度较低；RNA测序同样与免疫和炎症相关通路（包括细胞因子–受体相互作用、T辅助细胞相关通路、PI3K–Akt信号和NF-κB信号）的治疗相关分子偏移一致；这些微生物群和转录组观察为关联性，不确立与表型或屏障标志物变化的因果关系。关于局限性和转化意义，若干局限性制约解释：Cy5成像测量标记载体荧光而非组织MGF暴露，简化的序贯pH实验不确立结肠特异性靶向或改善的生物利用度；未报告仅载体生物学比较，因此DA–CMCS、海藻酸盐和MGF的贡献无法分离；体重和DAI推断限于预设第8天终点，描述性轨迹不确立治疗×时间效应；组织病理学由不知分组分配的观察者使用定义的半定量评分评估，但每组仅3只动物评分且未进行形态计量分析，因此该分析强度有限且不能完全排除观察者依赖性解释；微生物群和RNA-seq结果为关联性，微生物群分离的多变量显著性、独立转录验证和功能因果性尚未被报告的分析确立；低读取计数和有限生物学重复可降低检测差异表达的效能，因此未能将某转录本鉴定为差异表达不应被解释为其生物学无响应的证据；CD86/CD206和iNOS/CD206测量表明标志物变化而不独立确立巨噬细胞极化；最后，急性DSS模型和每组3只小鼠的7天相容性研究提供有限的临床前证据，不确立临床疗效或全面安全性。这些边界支持进一步的制剂表征、载体对照研究、直接暴露测量、相关情况下的轨迹水平分析、形态计量组织病理学和靶向机制验证。

研究结论翻译：总体而言，本研究表明将DA–CMCS自组装纳米胶束与Ca²⁺交联的海藻酸钠微球整合，为DSS概念验证模型中MGF口服递送提供了一种肠道pH响应性制剂策略。DA–CMCS支持MGF分散和纳米胶束形成，而海藻酸盐基质在酸性条件下抑制释放并在肠道相关pH下崩解。Cy5成像证明了制剂水平的增强肠道荧光，但未量化MGF暴露。该制剂与较低的氧化和炎症读数、较低的组织学评分、较高的上皮屏障标志物信号、巨噬细胞相关标志物变化以及关联性微生物群和转录组偏移相关，并具有初步短期相容性。这些发现支持使用直接药代动力学、仅载体对照、形态计量组织病理学、机制验证和工艺放大表征进一步评价该平台。