基于GBS简化基因组测序和全基因组关联分析鉴定小豆（Vigna angularis）抗锈病基因

《Plants》：Identifying Genes Conferring Rust Resistance in Adzuki Bean (Vigna angularis) Through Genome-Wide Association Analysis Based on Genotyping-by-Sequencing (GBS)

小豆（Vigna angularis）是一种重要的食用豆类作物，锈病严重制约其生产。鉴定抗性基因对于通过标记辅助育种加速抗锈病品种的选育至关重要。本研究对178份小豆种质进行了简化基因组测序（GBS），共产生124.87 Gb测序数据，获得12,153个高质量单核苷酸多态性（SNP）标记，全基因组平均密度为26.56 SNPs/Mb。主成分分析（PCA）和K-means聚类将178份种质划分为三个 distinct 遗传簇，前五个主成分解释了31.90%的总遗传变异。基于这些SNP的群体结构分析显示，交叉熵准则在K = 7时达到最小值，将供试群体划分为七个遗传亚群（C1–C7）。邻接法系统发育树进一步将种质解析为五个主要类群。在温室条件下采用人工接种Uromyces vignae分离物ZXL01评估苗期抗锈性，并在单一试验点通过自然田间感染评估成株期抗锈性。针对两种评估分别进行全基因组关联分析（GWAS），鉴定出15个与抗锈性显著相关的SNP。苗期在1号和3号染色体上鉴定出10个SNP，其余5个SNP在成株期于9号染色体上检测到。将与成株期抗锈性相关的SNP转化为竞争性等位基因特异性PCR（KASP）标记，随后在独立群体中进行验证。验证证实，抗性相关等位基因主要在高抗种质中检测到，表明这些标记在抗锈种质初步筛选中具有潜在应用价值，但仍需进一步的育种验证。

小豆（Vigna angularis）是豆科（Fabaceae）豇豆属（Vigna）作物，兼具食用和药用价值，全球30余个国家有栽培，中国为起源中心和最大生产国。然而，锈病（由Uromyces vignae引起）是制约小豆生产的重要病害之一，严重时可导致20–60%的产量损失。目前小豆抗锈育种主要依赖传统表型筛选，需完整生长季的田间评价，温室接种鉴定虽环境可控但费时费力且难以大规模应用，且锈病严重度受环境条件影响大，田间自然接种体分布不均常影响表型鉴定的准确性和重复性。标记辅助选择（MAS）可在不依赖性状表型表达的情况下鉴定标记基因型，减少对田间评价的依赖并实现早期选择。随着小豆高质量参考基因组的公布和高通量测序技术的进步，大规模开发和应用分子标记已成为可能。近年来，小豆抗锈分子机制研究取得了一定进展，已克隆了VaNATA1和VaDREB1A等基因，并鉴定了9个受锈菌诱导的NAC转录因子，但功能验证仅限于VaNAC002。VaEG45被证实可通过β-1,3-葡聚糖酶活性抑制锈菌发育。在基因组研究方面，自小豆草案基因组发布以来，已有基于SLAF-seq的高密度遗传图谱构建和种子大小QTL分析等报道，全基因组重编序（WGRS）加速了性状定位，利用GWAS已鉴定出与叶形态、种子铁积累等相关的位点，546份种质重测序鉴定出251个与八项关键农艺性状显著相关的位点。然而，小豆抗锈基因的遗传定位仍十分有限，迄今仅初步定位了一个抗性基因VaRust1。因此，本研究旨在通过GBS获取全基因组SNP并分析178份小豆种质的遗传结构，在温室苗期接种和田间成株期自然感染两种环境下评价抗锈表型，通过GWAS检测与抗锈性显著相关的SNP位点，并在独立群体中验证显著SNP以筛选可靠候选标记，为标记辅助抗锈育种提供遗传资源和选择工具。

研究人员开展的研究主要包括以下关键技术方法：对178份小豆种质进行GBS测序，使用PstI-HF/MspI酶切构建文库，Illumina NovaSeq平台PE150测序，BWA-MEM比对参考基因组GCF_016808095.1，GATK4 HaplotypeCaller进行SNP检测；利用PCA、K-means聚类、LEA包群体结构分析和邻接法（NJ）系统发育树解析群体遗传结构；在温室（2021年）和田间（2022年，黑龙江八一农垦大学试验田）两个环境下评价锈病抗性，苗期采用0–4级侵染型分级，成株期计算病情指数（DI）；采用TASSEL 5中的混合线性模型（MLM）进行GWAS，以p < 1/12,153为显著性阈值；将显著SNP转化为KASP标记并在69份种质组成的验证群体中进行基因型分析。

研究结果如下：

2.1 GBS测序：对178份小豆种质进行GBS测序，获得855,255,382条高质量clean reads，平均每样本4,804,805条，总数据量124.87 Gb，Q20和Q30分别为95.67%和89.07%，clean reads比对参考基因组的平均比对率为89.71%，表明测序数据质量高且可靠。

2.2 SNP检测：经严格质控共获得12,153个高质量SNP位点，染色体间SNP密度从8号染色体的20.94 SNPs/Mb到1号染色体的33.70 SNPs/Mb不等，相差约1.6倍，全基因组平均密度为26.56 SNPs/Mb，平均每条染色体分布约1105个SNP。SNP总体分布较均匀，但在1、2、3、4、5和7号染色体上检测到SNP密集区域（>80标记/Mb），而在4、5、6和10号染色体上存在标记间隙，可能与着丝粒区域或重复序列富集区相关。

2.3 群体结构与遗传关系分析：PCA分析显示PC1–PC5分别解释14.20%、7.45%、3.88%、3.54%和2.83%的变异，累积贡献率为31.90%。基于前五个主成分的K-means聚类将178份种质分为三个遗传簇（Cluster 1含96份、Cluster 2含37份、Cluster 3含45份），三维PCA图中三簇清晰分离。LEA包群体结构分析显示交叉熵在K = 7时达到最小值0.41，将群体划分为七个亚群（C1–C7），分别含16（8.99%）、12（6.74%）、13（7.30%）、17（9.55%）、37（20.79%）、30（16.85%）和53（29.78%）份种质，亚群间等位基因频率差异显著。基于欧氏距离矩阵的NJ系统发育树将178份种质分为五个主要类群，Group I–IV分别含3、8、2和4份种质，Group V数量最多并进一步分为V-1（主要来自河北）和V-2（主要来自黑龙江），V-2又可细分为五个遗传簇。

2.4 锈病抗性评价：苗期178份种质的侵染型呈连续分布，侵染型"0"（高抗）仅1份（0.56%），"1"（抗）和"2"（中抗）分别为12份（6.74%）和50份（28.09%），"3"（中感）最多为65份（36.52%），"4"（高感）为50份（28.09%）。田间成株期病情指数范围为0.00–100.00，呈广泛连续分布，16份种质DI低于10，其中IIE100041和IIE100099的DI为0，表现为完全抗病。

2.5 抗锈性关联分析：GWAS以p < 1/12,153 = 8.23 × 10^?5（?log₁₀(p) > 4.08）为阈值。苗期分析鉴定出10个显著SNP，其中8个位于1号染色体、2个位于3号染色体；成株期分析检测到5个显著SNP，均位于9号染色体。1号染色体上的8个SNP聚集在100 bp窗口内，提示强连锁不平衡（LD）。两个阶段间未检测到重叠SNP，提示苗期和成株期抗锈性可能由不同遗传位点控制。

2.6 抗锈相关位点的应用：将9号染色体上5个与成株期抗锈性显著相关的SNP转化为KASP标记，在69份表型连续分布种质中进行验证。结果显示5个SNP形成两种主要单倍型：携带C-T-T-A-A突变单倍型的4份种质（IIE100041、IIE100103、IIE100074和IIE100058）病情指数极低（0–3.18），表现为免疫或高抗；而携带A-G-A-C-G单倍型的绝大多数种质病情指数范围广泛（5.96–100.00），涵盖高抗至高感表型，仅少数种质（如Liaohong1hao和Liaohong3hao）DI低于10。

讨论部分：研究人员指出，与全基因组测序相比，GBS成本效益高，适于大规模群体遗传研究，本研究的12,153个SNP标记足以支持有效的GWAS。GBS在小豆中已有成功应用先例（366份地方品种获得6586个SNP）。近年来小豆基因组资源不断完善，染色体水平基因组组装覆盖447.8 Mb（占估计基因组的96.32%），contig和scaffold N50分别为16.5 Mb和41.0 Mb，BUSCO完整性达98.2%，注释25,939个基因。利用第二、三代测序结合Hi-C技术组装了"京农6号"基因组并重测序322份种质，鉴定出1,352,825个SNP；546份种质重测序鉴定出251个与关键农艺性状相关的位点，展示了WGRS的优越分辨率。与WGRS相比，本研究的GBS标记密度较低，但足以鉴定9号染色体候选区域并开发KASP标记用于初步育种，未来需更高分辨率的WGRS-GWAS精准定位因果基因。基于K = 7的群体结构分析将178份种质划分为七个亚群，多数个体遗传背景相对单一，与其自花授粉特性一致，少数个体显示混合 ancestry，提示亚群间可能存在基因流。PCA的K = 3聚类与K = 7结构分析共同揭示了群体的层次化遗传结构，表明供试材料具有丰富的遗传多样性。两个阶段检测到的非重叠位点提示苗期和成株期抗性可能由不同遗传因子控制，但由于两种评估在生长环境、感染条件和表型测量方案上均存在差异，本研究无法区分发育阶段与评估条件的影响，阶段特异性抗性假说仍需在控制条件下进一步验证。小麦条锈病和白粉病中苗期抗性与成株抗性的分化已有充分文献记载。成株期关联分析在9号染色体上检测到5个显著SNP，提示该染色体可能携带重要抗锈基因组区域。KASP标记可视为与9号染色体基因组区域连锁的初步验证候选标记，但其仅在单一田间环境的4份高抗种质中验证了实用性，在更广泛遗传背景和不同感染条件下的预测可靠性尚待建立。由于5个SNP位于约35 kb区间内，它们可能代表单个关联区域或单倍型块而非5个独立位点，KASP标记标记的是该候选区域而非因果基因本身。该区域位于与已报道VaRust1（3号染色体）不同的染色体上，提示其可能代表一个不同的抗锈相关基因组区域，但仍需进一步确认。通过与豇豆QTL Ruv1和小豆VaRust1进行生物学和位置比较，本研究所用Uromyces vignae分离物ZXL01对豇豆非致病，表明两个物种间抗性机制不同；VaRust1位于3号染色体20.46–26.20 Mb区间，而本研究的两个苗期抗性SNP虽也位于3号染色体，但其物理位置（31,982 bp和54,870 bp）距VaRust1区间超过20 Mb，表明本研究所鉴定位点是新发现的、独立于先前报道的抗性因子。研究局限性包括：苗期接种仅使用单一锈菌分离物ZXL01，鉴于锈菌潜在的致病性变异，未来需用多个分离物验证；成株期GWAS仅在单一田间环境进行，缺乏多年多点表型数据；GBS标记密度相对低于WGRS，未来需用WGRS或高密度芯片进行精细定位。

研究结论部分翻译：本研究利用GBS对178份小豆种质进行全基因组SNP鉴定，获得12,153个高质量SNP并表征了群体遗传结构（PCA三簇、K = 7时七亚群）。基于苗期温室接种和成株期田间自然感染两套表型数据集，GWAS鉴定出15个与抗锈性显著相关的SNP：苗期10个（1号和3号染色体），成株期5个（9号染色体），两阶段间无重叠SNP。9号染色体上5个成株期SNP转化为KASP标记并在69份种质中验证，携带C–T–T–A–A单倍型的4份种质病情指数极低（0–3.18），表现为免疫或高抗表型。该9号染色体区域不同于已报道的VaRust1位点（3号染色体），可能代表一个新的抗锈相关区域。本研究为小豆抗锈标记辅助育种提供了候选基因组区域和潜在可用的KASP标记，但这些标记的预测可靠性仍需在更广泛遗传背景、多种环境和多个分离物中进一步验证。