《Journal of Experimental Nanoscience》：Evaluation of Trapa natans-derived AgNPs as antibacterial agent
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利用富含生物活性化合物的药用植物进行银纳米颗粒（AgNPs）的绿色合成，有助于克服物理与化学合成方法所面临的挑战。本研究以非常规药用植物Trapa natans（菱）茎的水提物为原料，探究了生物源性Tn-AgNPs的合成。通过颜色变化以及紫外-可见光谱中420
利用富含生物活性化合物的药用植物进行银纳米颗粒（AgNPs）的绿色合成，有助于克服物理与化学合成方法所面临的挑战。本研究以非常规药用植物Trapa natans（菱）茎的水提物为原料，探究了生物源性Tn-AgNPs的合成。通过颜色变化以及紫外-可见光谱中420–440 nm范围内表面等离子体共振（SPR）吸收峰的出现，确认了T. natans（Tn）-AgNPs的形成。采用傅里叶变换红外光谱（FTIR）鉴定了参与还原与稳定作用的官能团。透射电子显微镜（TEM）显示形成了长度约160–180 nm、宽度约15–30 nm的短银纳米棒。X射线衍射（XRD）分析表明所得Tn-AgNPs具有高度结晶结构。琼脂孔扩散试验表明，Tn-AgNPs对实验室参考菌株Pseudomonas aeruginosa（ATCC 27853）的抗菌效力随浓度升高而增强。此外，生长动力学试验显示24 h后生长吸光度显著降低。随后，抗溶血活性结果显示这些纳米颗粒在20 ppm以内具有生物相容性。该工作契合SDG3，并凸显了Tn-AgNPs作为替代性抗菌剂的潜力。
一、研究背景与问题
近年来，纳米材料与纳米颗粒的生态友好合成日益受到关注。纳米颗粒具有高比表面积、高稳定性、等离子体特性与光热特性等优良理化性质，可应用于光学、传感、医学、工程与环境修复等领域。富含植物化合物的药用植物是开发新药与抗生素的重要资源，但其治疗能力常因生物利用度有限、稳定性差与溶解度低而受限，纳米生物技术的最新进展为克服这些局限提供了策略。其中，银纳米颗粒（AgNPs）因具有多种抗菌作用模式——包括细胞膜破坏、活性氧（ROS）生成、酶过程与代谢途径及细胞稳态的破坏、程序性细胞死亡诱导、细菌群体感应与毒力破坏——而成为受关注的抗菌剂，含AgNPs的软膏亦被用于预防伤口与烧伤的细菌感染。
传统上，AgNPs可通过物理与化学方法合成。物理方法包括球磨等机械力、热解与气相冷凝等热力、电弧放电等电力以及激光烧蚀等光能手段，虽合成快速，但产率较低、能耗较高且粒径分布不一致。化学方法包括使用多元醇、硼氢化钠（NaBH4）、Tollens试剂、柠檬酸钠、元素氢与抗坏血酸等有机和无机还原剂的化学还原，虽产率高，但因涉及有毒试剂且需额外纯化步骤以防止聚集与污染，不具备可持续性，并带来生物学与环境风险。绿色合成利用植物提取物、细菌、真菌与天然生物活性分子作为生物封端与稳定剂，可避免有毒试剂与合成稳定剂的使用，对粒径具有更强控制能力，引导均匀成核，并支持可持续的药物与生物医学应用。
已有芒果、薄荷、柠檬草、辣木、芦荟等多种植物提取物成功用于AgNPs合成，其中的酚类与黄酮类等植物化学物作为天然稳定剂、还原剂与封端剂，并具有抗菌活性。T. natans（菱，又称Singhada）为原产于非洲与欧亚大陆的富营养一年生浮水植物，属Trapaceae科；其果皮提取物含单宁、黄酮、糖苷、生物碱、皂苷、甾体与酚类化合物，果实含蛋白质、碳水化合物、Zn、Fe、Ca、K等矿物质、维生素B及重要氨基酸，是功能性食品，也是膳食纤维与脂肪酸的优良来源。研究表明果皮总酚含量显著高于内仁，凸显其作为强效抗菌与抗氧化剂的潜力；Trapa属富含没食子酸与单宁等生物活性化合物，是理想的"纳米工厂"。近期由P. aeruginosa引起的尿路感染（UTI）激增，其比较死亡率与发病率很高，耐药形式的出现与抗菌治疗选择有限使情况更为复杂，针对P. aeruginosa致病菌株的文献与可用治疗选择匮乏，亟需关注。
二、研究内容与结论
本研究利用非常规药用植物T. natans成功合成了Tn-AgNPs，以T. natans茎的水提物作为天然还原剂将硝酸银转化为Tn-AgNPs。通过紫外-可见光谱、X射线衍射（XRD）与透射电子显微镜/选区电子衍射分析（TEM/SAED）对纳米颗粒进行光学表征，采用FTIR考察表面相互作用与官能团。通过琼脂孔扩散试验与生长动力学试验评估合成Tn-AgNPs对P. aeruginosa的抗菌效力，并对不同浓度颗粒筛查溶血活性以评估血液相容性。研究为植物化学物介导的Tn-AgNP形成及其对实验室参考菌株P. aeruginosa的抗菌性能提供了新见解，并评价了Trapa源性AgNPs作为新型抗菌替代方案的效力。
三、主要关键技术方法
研究采集印度古吉拉特邦Patan田间（23.8500° N，72.1210° E）的T. natans植株，取新鲜茎切段、去离子水反复冲洗以去除灰尘杂质，55 °C热风烘箱干燥5天，电磨粉碎为细粉，置于无菌密封袋保存备用。采用改良的Khanal等方法进行水提：将10 g茎粉加入盛有100 ml双蒸水的500 ml烧杯中，热板加热1 h，冷却后经Whatman No. 1滤纸过滤并于3000 rpm离心10 min。参照Gupta与Saxena及Roy等方法并作改动合成Tn-AgNPs：滤液与1 mM硝酸银溶液按1:1比例避光室温孵育48 h，颜色由黄变褐确认形成，悬液于4 °C下9000–10,000离心5 min获得沉淀，洗涤后55 °C烘干、避光过夜，刮取保存于4 °C。表征方面，用紫外-可见分光光度计于200–800 nm扫描获取SPR峰值；对冻干粉进行FTIR分析；用透射电子显微镜（JEOL，JEM 2100 Plus）进行TEM/SAED分析；用X射线衍射仪（Bruker D8 Advance）以Cu Kα辐射（λ = 1.5406 ?；45 kV，30 mA）获取衍射数据。抗菌试验以P. aeruginosa（ATCC 27853）为模型菌株，先在营养琼脂平板上复苏并于37 °C培养24 h。琼脂孔扩散法以庆大霉素为阳性对照、水提物滤液为阴性对照，菌液调至0.5麦氏浊度涂布于Mueller–Hinton琼脂平板，以直径10 mm无菌打孔器打5孔，分别加入10 ppm、20 ppm、50 ppm的Tn-AgNPs悬液及阳性和阴性对照，37 °C孵育24 h后记录抑菌圈。生长动力学试验将调至0.5麦氏浊度的菌液转入无菌比色皿，在Tn-AgNPs存在下用紫外-可见分光光度计每2 h记录600 nm吸光度，持续24 h。红细胞（RBC）溶血试验在5、20、50、100 ppm Tn-AgNPs存在下进行，人全血经Parul Sevashram医院（PSH）机构伦理委员会（PUIECHR/PIMSR/00/081734/7502）批准后采集，离心纯化RBC，取108个RBC与各浓度Tn-AgNPs于37 °C孵育30 min，5000 rpm离心5 min收集上清，于540 nm记录吸光度，以PBS与Triton X-100处理的RBC分别为阴性与阳性对照。
四、研究结果
3.1 Tn-AgNPs的合成：植物提取物中多酚、黄酮、还原糖、生物碱、皂苷、糖苷与单宁等丰富植物化学物作为还原剂与封端剂，可提供电子将Ag+转化为元素Ag。颜色由淡黄变褐表明生物活性分子还原银离子的氧化还原反应发生，紫外-可见光谱中420–440 nm出现强SPR吸收峰验证了Tn-AgNPs的合成。
3.2 表征：FTIR在4000–400 cm?1范围采集植物提取物与Tn-AgNPs谱图，Tn-AgNPs在3297.68与1636.3 cm?1呈现两个明显峰，前者对应O─H伸缩振动，指示醇类、多糖、酚类、吸收水、植物源性封端剂或蛋白质中的羟基；后者对应强C═O伸缩，指示蛋白质的酰胺I基团和/或水。这些含羟基与羰基的生物分子作为还原与稳定剂防止过度聚集。提取物中另见1381.75、1257.36与1149 cm?1峰，分别对应萜类甲基C─H对称弯曲、芳香酯C─O伸缩以及生物碱与氨基酸。TEM显示合成Tn-AgNPs高度结晶且呈 elongated 棒状，按200 nm标尺，单个纳米棒长约160–180 nm、宽15–30 nm；纳米棒以聚集体形式存在，最长方向约450–600 nm、宽约300–450 nm。SAED图谱以离散斑点表明其结晶性。与既往报道的球形、三角形与多边形AgNPs不同，本工作报告了短银纳米棒的形成。XRD在33.9°、35.5°、38.6°、48.9°、58.2°、61.5°的2θ峰分别对应晶面111、200、220与311，与标准ICDD数据库（卡片号#00-004-0783）良好吻合，表明合成了面心多晶银纳米颗粒；因采用生物途径合成，可能存在其他物相。
3.3 抗菌试验（孔扩散法）：10 ppm Tn-AgNPs对P. aeruginosa无抑制作用；20 ppm与50 ppm则分别产生28.6 ± 0.9 mm与40.2 ± 0.4 mm的抑菌圈，抑菌圈直径随浓度增大表明浓度依赖性抗菌活性。AgNPs表面释放的银离子主要通过与脂质、蛋白质与DNA等对细菌存活重要的生物分子发生胞内相互作用而发挥抗菌作用，可对核糖体组分造成不可逆损伤并破坏二硫键，导致蛋白质错误折叠而功能丧失与代谢受损；AgNPs还促进ROS形成，通过抑制ATP合成与复制导致凋亡。基于既往研究推测，Tn-AgNPs通过ROS生成、膜损伤、蛋白质降解与细胞稳态破坏发挥抗菌活性。本研究中水提物滤液未抑制P. aeruginosa，表明抗菌活性主要归因于生物合成的Tn-AgNPs。
3.4 生长动力学试验：20 ppm Tn-AgNPs对P. aeruginosa表现出抗菌效力，该浓度在孔扩散试验中产生的抑菌圈与合成抗生素相当。紫外-可见光谱显示Tn-AgNPs存在时P. aeruginosa生长显著下降，处理组吸光度较未处理组显著降低，与琼脂孔扩散试验结果一致。AgNPs通过静电吸引与疏水相互作用与细菌膜和蛋白质的关键组分相互作用，其相互作用还受纳米材料物理结构、表面性质与形貌调控。细菌生长抑制可能与银离子释放导致的膜完整性破坏、ROS形成、蛋白质降解与细胞稳态破坏高度相关，其抗菌机制假说尚待未来研究验证。
3.5 RBC溶血试验：在5、20、50与100 ppm Tn-AgNPs存在下进行，20 ppm时无显著溶血（2.9%）；但50 ppm及以上RBC发生裂解，表明20 ppm是使用Tn-AgNPs发挥抗菌活性的最安全浓度。
五、讨论与结论
作者指出，本研究的主要局限在于仅在常规in vitro条件下评价了一株参考菌株，未研究临床UTI分离株、尿液条件、生物膜形成、导管相关生物膜或体内效力；因此基于这些初步发现，未来应针对临床UTI分离株开展研究以验证Tn-AgNPs对致UTI病原体的抗菌特性。研究结论译文如下：在本研究中，研究人员通过绿色途径利用T. natans茎的水提物合成了生物源性Tn-AgNPs。合成最初由淡黄至褐的颜色变化所确认，随后SPR吸收峰的出现验证了AgNPs的形成。对T. natans介导AgNPs的FTIR分析表明，含羟基与羰基的生物活性分子作为还原剂与稳定剂，防止Tn-AgNPs过度聚集。TEM分析显示所得Tn-AgNPs为银纳米棒结构，单个银纳米棒长约160–180 nm、宽15–30 nm，纳米棒以聚集体形式存在，最长方向尺寸约450–600 nm。最后，通过孔扩散法与在Tn-AgNPs存在下分光光度监测生长动力学，确认了Tn-AgNPs对P. aeruginosa的抗菌活性。总之，本研究为利用T. natans茎水提物简便且生态友好地合成具有抗菌潜力的Tn-AgNPs作出了贡献。
