登革病毒前体膜蛋白第69位糖基化位点对其在C6/36和Vero细胞中复制的必需性研究

《Viruses》：Glycosylation of the Premembrane Protein Is Required for Dengue Virus Replication in Both C6/36 and Vero Cells

　　

登革病毒（Dengue virus, DENV）是一种蚊媒传播的正链单股RNA病毒，包含四个血清型（DENV1-4），每个血清型可进一步分为不同的基因型。DENV每年导致约1亿人类感染。DENV病毒粒子编码一个被脂质双层包围的衣壳（capsid, C），该脂质双层编码两种糖蛋白，包膜（envelope, E）蛋白和前体膜（premembrane, prM）蛋白。在病毒粒子成熟过程中，前体膜蛋白被切割形成成熟病毒粒子，包括部分成熟和完全成熟颗粒。DENV病毒粒子的成熟状态既影响DENV的感染性，也影响抗体中和病毒的能力。prM糖蛋白在所有的DENV中均发生糖基化且高度保守。特别是，第69位的N-连接糖基化（N-linked glycosylation）位点存在于超过99%的DENV基因组中。在本研究中，研究人员通过构建DENV2和DENV4功能丧失型病毒来研究N69糖基化位点的重要性。这些N69糖基化敲除病毒是通过在69位点引入单个氨基酸突变而产生的。尽管在体外进行了多次传代，两种突变病毒均未产生可检测的病毒滴度。为了进一步研究该糖基化位点的重要性，研究人员构建了另一种变异株，即将N-连接糖基化位点重新定位到紧邻69位残基的位置。其中一位点邻近糖基化突变株显示其病毒复制水平接近野生型（wild-type, WT）DENV菌株。总体而言，本研究表明在prM蛋白第69位保留一个N-连接糖链对于DENV感染蚊虫细胞是必需的，并且在第69位附近插入一个糖基化位点可能恢复部分DENV4毒株的感染性。

登革病毒（Dengue virus, DENV）是一种蚊媒传播的正链单股RNA病毒，分为四个血清型（DENV1-4），每年导致全球约1亿人感染。DENV病毒粒子被脂质双层包围，含有衣壳（capsid, C）、前体膜（premembrane, prM）和包膜（envelope, E）三种结构蛋白。prM作为分子伴侣确保E蛋白正确折叠，并防止子代病毒与宿主细胞过早膜融合，对病毒组装、成熟及感染性至关重要。病毒复制过程中会发生N-连接糖基化（N-linked glycosylation），尽管第69位糖基化位点在超过99%的DENV基因组中高度保守，但其在DENV复制、成熟和感染中的具体功能此前尚未得到充分研究。

现有研究已证实E蛋白和NS1蛋白的糖基化对DENV毒力、复制及免疫逃逸具有重要影响，但prM蛋白糖基化的作用，特别是第69位N-连接糖基化位点的生物学功能仍不清楚。该位点跨所有血清型的高度保守性提示其对病毒生存不可或缺，然而缺乏直接的实验证据。因此，研究人员有必要利用反向遗传学手段系统评估该位点对DENV复制的必需性，并探究糖链空间位置的重要性。

研究人员以DENV2（S16803）和DENV4（Sri Lanka/1992）为骨架，通过定点突变（site-directed mutagenesis）技术在prM蛋白第69位引入功能丧失型突变，构建糖基化敲除病毒；同时将近邻的第27位或第57位改造为新的N-连接糖基化位点，构建邻近糖基化突变株。研究在C6/36蚊虫细胞和Vero81哺乳动物细胞中系统评估了这些突变株的复制适应性。研究结果明确了第69位糖基化对DENV复制的严格必需性，并揭示了在特定DENV4毒株中，邻近糖基化位点可部分补偿功能，为理解DENV组装机制和糖基化位点的功能可塑性提供了重要实验依据。

在技术方法方面，研究人员主要采用反向遗传学四质粒系统构建重组病毒，通过定点突变技术引入特定氨基酸替换。利用MUSCLE程序对来自Virus Pathogen Resource（ViPR）数据库的1,695株DENV2和272株DENV4全基因组序列进行比对，验证第69位糖基化位点的高度保守性。通过体外转录（in vitro transcription）和电穿孔（electroporation）将病毒基因组RNA导入C6/36细胞以拯救病毒，并在C6/36与Vero81细胞中连续传代，结合免疫染色（immunostaining）、蛋白质免疫印迹（Western blot）及病毒生长曲线测定评估病毒复制动力学。

3.1. Loss of Glycosylation Site at Position 69 of prM Prevents DENV Replication
研究人员构建了DENV2ΔGLY1（N69H）、DENV4ΔGLY1（N69D）和DENV4ΔGLY2（T71A）三种糖基化位点敲除突变株。在C6/36和Vero81细胞中的传代实验显示，尽管电转后第0代可检测到轻微病毒复制，但后续传代中均未出现可检测的病毒，表明第69位糖基化对DENV复制不可或缺。值得注意的是，DENV2ΔGLY2在第3代出现复制，但测序证实该突变已回复为野生型序列，确认为回复突变株（revertant）。

3.2. Insertion of Glycosylation Site near Position 69 of prM
研究人员将糖基化位点重新定位至第27位或第57位，构建四种邻近糖基化突变株。DENV2ΔADD1、DENV2ΔADD2及DENV4ΔADD1在传代后均无病毒复制。然而，DENV4ΔADD2（V57N）在C6/36细胞中表现出稳健复制，第2代病毒滴度与野生型（wild-type, WT）DENV4相当。蛋白质免疫印迹证实感染上清中E蛋白（~53 kDa）和prM蛋白（~22 kDa）的表达水平与野生型一致。复制动力学分析表明，DENV4ΔADD2在C6/36细胞中的生长速率和峰值滴度（~10 × 10⁵ FFU/mL）与野生型相似；在Vero81细胞中，其复制速率低于野生型，峰值滴度亦低于野生型（~10 × 10⁶ FFU/mL），但差异无统计学意义（Mann–Whitney U检验，p > 0.05）。

讨论部分指出，糖基化敲除病毒的复制缺陷很可能是由于第69位糖链缺失所致，因为这些突变设计模拟了天然分离株DENV2_TSV01和DENV4_GD09/90。尽管这些天然株能够克服复制缺陷，但其可能携带其他补偿性突变或非N-连接糖基化修饰，具体机制仍需进一步研究。研究表明，prM第69位N-连接糖基化对DENV在C6/36和Vero81细胞中的组装和/或复制至关重要，可能通过促进病毒粒子出芽或增强感染性来发挥作用。此外，仅DENV4ΔADD2表现出接近野生型的复制水平，提示第69位附近的某些邻近糖基化位点可部分补偿功能，但第27位或DENV2对应位点则不足以恢复复制。这种差异可能与第59位氨基酸残基差异或其他病毒骨架特性有关。

翻译研究结论：本研究表明，prM蛋白第69位的N-连接糖基化位点对登革病毒在蚊虫和哺乳动物细胞中的感染性与复制能力具有严格的必需性。在DENV4中，将近旁的第57位改造为新的糖基化位点可恢复病毒复制能力，提示该糖链的空间位置对病毒适应性具有重要影响，且部分DENV4毒株对邻近糖基化位点具有功能可塑性。