NK细胞免疫疗法在HIV-1治疗与疫苗研发中的应用：机制、策略与前景

《Viruses》：Harnessing Natural Killer Cells for HIV-1 Treatment and Vaccine Development: A Review

　　

1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）可导致进行性免疫功能障碍，未经治疗可进展为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）。联合抗逆转录病毒治疗（cART）虽能有效抑制病毒复制并显著改善HIV感染者（PLWH）的临床结局，但无法清除持续存在的病毒储存库，且需终身用药。因此，研究人员持续探索可能增强抗病毒免疫、并有助于HIV-1预防、缓解或清除的免疫治疗策略。自然杀伤（NK）细胞因其固有细胞毒活性、功能多样性、可塑性，以及表达参与抗病毒应答的受体（包括NKG2受体家族和CD16），已成为HIV-1研究中颇具前景的候选细胞。目前有多种基于NK细胞的免疫治疗策略正在研究中，其机制与潜在应用各不相同。本综述梳理了NK细胞免疫治疗用于HIV-1的当前研究格局，并重点介绍与HIV-1疫苗研发潜在相关性最高的策略，包括一个提出的概念模型。研究人员通过PubMed检索文献，检索词包括"NK cells""HIV""HIV vaccine"和"NK immunotherapies"。现有证据提示，多种基于NK细胞的策略具有可观的抗病毒活性，并支持继续研究用于HIV-1治疗与预防的NK细胞免疫治疗，尤其是可能为有效HIV-1疫苗研发提供启示的策略。

1. 1.
   引言
   免疫对维持机体生存与健康至关重要。人类免疫系统分为固有免疫与适应性免疫两部分：固有免疫通过种系编码的识别机制提供快速应答，适应性免疫则涉及抗原特异性B细胞和T细胞应答，并形成免疫记忆及针对病原颗粒的特异性抗体以将其清除。HIV-1主要感染CD4⁺ T淋巴细胞，导致进行性免疫功能障碍及适应性免疫应答受损；淋巴组织内持续病毒感染与慢性滤泡性炎症可破坏滤泡辅助性T细胞功能，间接引起B细胞失调与抗体应答受损。未经有效治疗，HIV-1感染可逐步削弱免疫系统并导致AIDS，PLWH通常接受cART以抑制病毒复制、减少对新宿主细胞的感染。免疫治疗通过调动或改造免疫应答来对抗疾病，NK细胞免疫疗法已在肿瘤治疗中因其直接细胞毒作用及工程化受体介导机制而受到研究，这些进展促使研究人员将类似策略用于包括HIV-1在内的持续性病毒感染。Mazarzaei等报道NK细胞能够有效识别并清除HIV感染细胞。NK细胞传统上被视为固有免疫系统的一部分，通过识别并清除感染或异常细胞参与免疫监视；研究显示部分NK细胞对HIV相关靶标表现出记忆样、抗原特异性应答，这一发现因与分子结构类似HIV的猴免疫缺陷病毒（SIV）研究的适用性而备受关注。SIV感染的非人灵长类（NHP）模型为逆转录病毒免疫研究提供了有价值的转化信息，尤其涉及适应性及记忆样NK细胞应答的形成；由于SIV与HIV-1共享重要的生物学和免疫病理学特征，这些模型为研究NK细胞介导的抗病毒免疫、评估潜在免疫治疗与疫苗策略提供了实验框架。本综述先简要概述NK细胞生物学与作用机制，继而考察针对HIV感染细胞已显示或被认为具有活性的NK细胞免疫治疗谱系及HIV反应性NK细胞亚群，随后重点讨论更可能促进HIV疫苗研发的策略，最后提出一个基于NK细胞的HIV-1免疫治疗与疫苗研发概念模型，并讨论NK细胞免疫治疗的未来方向及其在推动HIV研究中的潜在作用。
2. 2.
   固有免疫：自然杀伤（NK）细胞
   固有免疫细胞是抵御入侵病原体的早期防线，并参与炎症反应的启动与调控，包括巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞和NK细胞。NK细胞起源于共同淋巴样祖细胞，能迅速识别并清除病毒感染或恶性细胞，其应答取决于活化信号与抑制信号的平衡，后者可因MHC I类分子表达降低或活化受体配体表达升高而改变。与常规细胞毒性T淋巴细胞不同，NK细胞无需预先抗原特异性致敏即可识别并清除感染或恶性细胞；其抗病毒功能包括直接细胞毒作用及分泌促炎细胞因子，尤其是干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α），这些细胞因子通过促进巨噬细胞活化、调控炎症信号及促进固有免疫与适应性免疫细胞间通讯而参与抗病毒免疫应答。因此，NK细胞已成为包括HIV在内的多种癌症和病毒感染免疫治疗研究的重要靶点。尽管NK细胞传统上归类为固有免疫组分，新证据提示某些NK细胞群体可获得适应性或记忆样特性；近期研究已鉴定出人NK细胞针对HIV相关靶标的抗原特异性反应性，挑战了固有免疫与适应性免疫的传统界限，这些HIV反应性NK细胞因其在抗病毒免疫治疗与疫苗研发中的潜在应用而备受关注。
3. 3.
   NK细胞的作用机制
   NK细胞在体内能有效识别并清除异常或病变细胞，其发育于骨髓，约占循环淋巴细胞的10–15%；趋化因子可招募NK细胞至感染部位，活化受体与抑制受体及其配体的相互作用有助于区分感染细胞与未感染细胞。NK细胞活化受靶细胞相互作用产生的活化信号与抑制信号平衡调控，其识别的基本机制之一为"缺失自我"识别，即主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子表达降低削弱抑制性受体信号，增加对NK细胞介导细胞毒作用的易感性。生理条件下，抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）识别特定人类白细胞抗原（HLA）I类分子，防止健康细胞被破坏；HIV-1可通过Nef和Vpu等病毒辅助蛋白改变MHC-I表达，从而可能改变NK细胞识别，但NK细胞活化仍取决于抑制信号与活化信号的整合而非单纯MHC-I缺失。活化性KIR也参与NK细胞识别，但通常不作为识别肽结合抗原的常规T细胞受体发挥作用，例如KIR3DS1已被证明可识别某些HLA-F开放构象，体现了NK细胞活化中受体-配体相互作用的多样性。除受体介导识别MHC-I表达改变外，NK细胞还可通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）清除抗体包被的靶细胞，该机制主要由CD16（FcγRIIIa）介导，即表达于部分NK细胞上的活化性Fc受体识别结合于靶细胞抗原的免疫球蛋白G（IgG）抗体Fc段；CD16交联启动细胞内信号通路，促进NK细胞脱颗粒并释放穿孔素和颗粒酶，最终诱导靶细胞凋亡。在HIV-1感染中，针对病毒包膜蛋白的抗体可通过ADCC促进NK细胞识别并破坏感染细胞；近期研究利用同时识别HIV-1 Env与CD16的双特异性抗体构建体，促进NK细胞介导清除表达可检测病毒抗原的HIV感染储存库细胞。NK细胞还可通过死亡受体介导信号诱导凋亡：NK细胞表达Fas配体（FasL）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）等死亡配体，分别结合靶细胞上的Fas（CD95）及DR4、DR5，激活细胞内凋亡信号通路；此外，NK细胞可通过含穿孔素和颗粒酶的细胞毒颗粒外排直接清除感染细胞。上述互补机制共同构成NK细胞的抗病毒功能，其多样化抗病毒功能促使研究人员探索利用其活性对抗HIV感染细胞。
4. 4.
   基于NK细胞的免疫治疗
   NK细胞疗法仍相对较新，但在HIV导向免疫治疗与储存库靶向方面显示出潜力。人和恒河猴研究显示NK细胞可形成抗原特异性记忆应答；KIR基因与HLA基因的遗传变异可能影响NK细胞控制HIV感染的能力。KIR与HLA为位于不同染色体的独立基因家族：KIR基因位于19号染色体，编码MHC分子的HLA基因位于6号染色体。KIR为表达于NK细胞表面的受体，依具体受体不同可为活化性或抑制性，其与靶细胞表达的HLA I类配体相互作用，不同遗传性KIR/HLA组合可影响NK细胞活性与HIV疾病结局，例如携带KIR3DS1及第80位为异亮氨酸的HLA-Bw4等位基因与HIV疾病进展较慢及CD4⁺ T细胞下降速率降低相关。适应性NK细胞亚群的发现推动了对嵌合抗原受体（CAR）工程化NK细胞的研究兴趣；CAR-T细胞疗法虽显示前景，但受制于高昂制造成本及严重体内毒性，包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）；相比之下，CAR-NK细胞因可能具有更有利的安全性特征、严重CRS、神经毒性及移植物抗宿主病（GVHD）风险较低而受到关注。Ram等与Zenere等讨论了CAR技术可用于开发HIV反应性CAR-NK细胞作为HIV-1治疗策略的证据，通过CAR介导识别与NK细胞细胞毒作用，这些细胞可能有助于靶向并清除HIV-1感染细胞；诱导多能干细胞来源NK细胞（iPSC来源NK细胞）是正在研究的CAR-NK细胞治疗平台之一。Ni等发现CD4/CD3ζ CAR表达可改善干细胞来源NK细胞在体外对HIV复制的抑制，但在人源化小鼠模型中CAR表达较未修饰NK细胞并未显著改善抑制效果。Board等研究了单链双抗体（scDbs）促进NK细胞介导清除HIV感染细胞（包括接受抑制性ART患者来源细胞）的作用：通过靶向HIV-1包膜蛋白（Env）与人III型Fcγ受体（CD16），可在潜伏逆转后于体外激活NK细胞清除高达72%携带完整HIV-1原病毒的CD4⁺ T细胞；该scDbs整合高亲和力CD16单链可变区片段（scFv），诱导的NK细胞活化与感染细胞杀伤强于亲本IgG广谱中和抗体，活性与既往报道的Env-CD16双特异性抗体相当，且无需IL-2或IL-15预刺激；在人源化小鼠中，该治疗可减少HIV感染细胞储存库并整体降低HIV建立储存库的能力。研究人员发现Env缺失、5'端缺失或主要剪接供体位点缺陷会限制NK细胞减少储存库的能力，但提出可通过工程化双特异性抗体靶向宿主MHC/HLA分子呈递的HIV衍生肽以弥补Env缺陷；该研究为利用NK细胞清除HIV患者潜伏储存库奠定基础，并因其降低整体HIV储存库建立的能力而为HIV疫苗研发提供启示。此外，近期研究提示利用NK-92细胞清除HIV-1感染细胞的潜在益处。Choudhary等讨论了源自人NK细胞淋巴瘤系的NK-92同种异体细胞因其转导效率与功能活性而可能具有的用途；同种异体NK细胞较自体细胞可能具有优势，因早期CAR-NK细胞试验显示GVHD发生率低、CRS发生率较低。此外，将广谱中和抗体（bNAbs）与通用CAR修饰NK-92细胞联合引入了靶向HIV-1感染细胞的新方法：在该系统中，2,4-二硝基苯基（DNP）作为化学标签或小分子衔接子连接于bNAb，bNAb结合HIV感染细胞上的HIV Env（如糖蛋白160，gp160），而通用CAR-NK-92细胞通过工程化抗DNP受体识别DNP标签，因此DNP标记抗体作为HIV感染细胞与CAR-NK-92细胞之间的桥梁而非直接病毒靶标；在CD28共刺激下，该衔接子策略已被证明可靶向HIV-1 B亚型和C亚型、改善表位覆盖并增强通用CAR NK细胞活化。然而，NK-92细胞存在关键转化局限：由于亲本NK-92系来源于NK细胞恶性肿瘤，临床产品通常需在输注前照射以防止不受控增殖，而照射又限制体内扩增与持续存在；未修饰NK-92细胞还缺乏内源性CD16介导的ADCC，但工程化变体可恢复该功能；这些限制可能需要重复给药，并使从临床前细胞毒试验外推至持久HIV储存库控制复杂化。尽管HIV-1可破坏NK细胞稳态并损害其部分功能，这些细胞多样的抗病毒特性使其成为HIV导向免疫治疗的有前景候选。总体而言，涉及适应性NK细胞、CAR-NK细胞、双特异性抗体介导靶向及基因修饰NK-92细胞的研究显示了增强NK细胞识别与清除HIV感染细胞的潜力，但仍需进一步研究确定这些方法的安全性、有效性及临床适用性。重要局限仍然存在：多数证据来自体外系统、工程化细胞系、人源化小鼠或非人灵长类，而非临床HIV治愈试验；储存库解剖分布、病毒抗原表达、NK细胞持续存在及免疫环境的差异限制了直接外推至PLWH；此外，病毒逃逸与异质性应答可能降低原本有前景的抗体或细胞干预的持久性。
5. 5.
   用于HIV疫苗研发的NK免疫治疗
   在目前研究的NK细胞方法中，利用NK细胞适应性与记忆样特性的策略对HIV疫苗研发可能尤为有前景。非人灵长类模型证据显示，接种SIV疫苗后可产生抗原特异性NK细胞应答，为研究针对HIV-1的类似策略奠定基础。若干潜在干预可能促进将NK细胞介导免疫纳入未来HIV疫苗策略，例如靶向抑制性NKG2A受体同时促进靶标依赖性CD16结合，可能增强适应性NK细胞清除HIV感染细胞的能力；NKG2A可抑制NK细胞活化，而CD16通过ADCC参与NK细胞介导的细胞毒作用，因此减少抑制信号同时增强靶标依赖性CD16结合的策略值得进一步研究。另一潜在方法是递送DNP修饰的广谱中和抗体（DNP-bNAbs）作为衔接子，将HIV感染细胞与通用CAR-NK细胞连接，促进靶向识别与细胞毒作用。近期研究进一步考察非人灵长类中观察到的抗原特异性NK细胞应答能否转化至人类。Jost等研究了针对HIV的抗原特异性记忆NK细胞应答特征及其可能调控机制，工作集中于三方面：（1）鉴定并验证记忆NK细胞针对HIV及其他病毒抗原的抗原特异性；（2）表征除既往涉及的抑制性受体NKG2A之外与抗原特异性靶向相关的NK细胞受体；（3）研究HLA-E相关肽及NKG2/HLA-E轴作为NK细胞对HIV-1和流感应答的潜在介质。基于SIV模型发现，研究者评估人记忆NK细胞是否可对HIV表现类似抗原特异性应答：取自PLWH和健康个体的NK细胞在暴露于HIV、EB病毒（EBV）、巨细胞病毒（CMV）和流感抗原后接受评估，B淋巴母细胞样细胞系（BLCLs）作为抗原呈递靶细胞以评估应答特异性；PLWH来源NK细胞表现出显著的HIV Gag特异性活性，而健康供者应答通常高于本底不可检出；MHC缺陷的K562细胞作为对照，呈递自身肽的BLCLs用于评估潜在自身反应性；这些实验共同提供证据表明人NK细胞可对HIV表现记忆样、抗原特异性应答，而非仅非特异性细胞毒活性。这些发现对疫苗研发具有重要意义：若疫苗接种能产生或扩增可识别HIV特异性抗原并在再次抗原暴露时作出应答的NK细胞群体，适应性NK细胞可能有助于更靶向的抗病毒免疫应答；因此鉴定负责这些应答的受体与抗原呈递通路对确定NK细胞记忆如何纳入未来HIV疫苗策略十分重要。Jost等进一步研究了与HIV特异性记忆NK细胞活性相关的NKG2受体：既往非人灵长类研究提示NKG2A/C参与抗原特异性NK细胞应答，但其发现提示NKG2C在人类记忆NK细胞靶标识别中可能尤为重要。NKG2/HLA-E轴独特之处在于抑制性受体NKG2A与活化性受体NKG2C可竞争同一配体HLA-E，因此NK细胞信号结局可能不仅取决于受体表达，还取决于HLA-E结合槽内呈递的特定肽；某些病毒肽-HLA-E复合物可能在结构上有利于活化性NKG2C介导识别而非抑制性NKG2A信号，使NK细胞应答转向活化。在此背景下，活化性受体NKG2C表达增加与NK细胞针对呈递HIV Env靶标的应答正相关，而NKG2A表达在人NK细胞样本中与HIV Env特异性靶向无显著相关；这些发现提示人类抗原特异性NK细胞应答的调控机制可能不同于既往在非人灵长类模型中表征的机制。研究者还考察了HLA-E——一种向NKG2家族受体呈递肽并可调节NK细胞活性的非经典MHC I类分子，其发现支持NKG2/HLA-E轴在针对HIV和流感的抗原特异性记忆NK细胞应答中的作用；该相互作用与疫苗研究尤为相关，因其提供了病毒肽经HLA-E呈递可能影响NK细胞接受抑制或活化信号的潜在机制。综上，现有证据提示NKG2/HLA-E轴是NK细胞HIV疫苗研究中值得继续探索的领域，进一步表征NKG2C表达、HLA-E呈递的HIV肽及有利于NKG2C活化而非NKG2A抑制的结构特征，对确定这些发现能否转化为人类有效疫苗策略十分必要；尽管这些方法仍属研究性，HIV特异性记忆样NK细胞活性的证实为探索NK细胞免疫的固有与适应性特征如何促进未来HIV疫苗研发提供了重要基础。
6. 6.
   提出的基于NK细胞的HIV-1免疫治疗与疫苗研发策略
   基于上述发现，研究人员提出一个整合多种NK细胞介导机制以增强识别与清除HIV-1感染细胞的概念性策略。首先，适应性NK细胞可提供抗原特异性或记忆样应答；其次，NKG2/HLA-E轴可决定NK细胞被抑制还是活化；第三，基于CD16和基于CAR的策略可增强靶标识别与细胞毒作用。该模型将这些机制整合为单一理论框架，不依赖单一NK细胞活化通路，而是结合活化性与抑制性NK细胞受体的效用与CAR介导的HIV-1包膜糖蛋白靶向。具体而言，研究人员提出同时增强靶标依赖性CD16结合与阻断NKG2A介导的抑制信号可促进持续的NK细胞细胞毒活性，而HIV特异性CAR提供对感染细胞的靶向识别；该设想虽为理论性，但增强工程化NK细胞克服抑制信号并有效靶向持续HIV-1感染的能力值得研究。NK细胞策略本身并非疫苗，但可能通过改善HIV特异性免疫识别、储存库靶向及抗病毒效应功能为治疗性疫苗研发提供启示。该模型第一组分涉及同时增强靶标依赖性CD16信号与阻断NKG2A介导的抑制：CD16参与NK细胞活化与ADCC，使NK细胞能清除抗体包被的HIV感染细胞；然而，非特异性CD16刺激理论上可触发全身性NK细胞活化与毒性，因此CD16活化需以靶标依赖方式进行，如通过设计为结合HIV感染靶标后促进CD16交联的HIV Env-CD16双特异性衔接子；相反，NKG2A作为抑制性NK细胞受体，阻断NKG2A信号已被研究作为克服NK细胞细胞毒作用抑制的策略。因此，研究人员假设靶标依赖性CD16结合与NKG2A阻断联合可使NK细胞信号转向活化；靶标依赖性结合旨在限制非特异性活化，但其在联合模型中的安全性需实验评估。在HIV-1背景下，这种双重调控可能增强工程化CAR-NK细胞的细胞毒能力，但同时靶向这些通路是否产生相加或协同抗病毒活性尚需实验验证。第二组分涉及工程化CAR-NK细胞识别感染细胞表达的HIV-1包膜蛋白：既往研究已证明针对HIV-1的CAR策略（包括靶向gp160的方法）的可行性；CAR-NK细胞理论上可源自iPSC谱系，经工程化识别gp160、gp41保守区或其他HIV相关靶结构，CAR结合后NK细胞细胞毒机制可促进HIV感染细胞凋亡；与靶标依赖性CD16结合及NKG2A介导抑制减少相结合，CAR依赖性识别可能为NK细胞靶向HIV-1感染细胞提供互补途径。该组合可能尤为有用，因其针对HIV感染细胞及潜伏储存库使用的多种免疫逃逸机制：HIV感染细胞可能上调HLA-E，后者结合NKG2A并抑制NK细胞活化；同时HIV Env表达可能多变、突变或不足，限制单一抗原导向方法的识别；将HIV特异性CAR或肽-MHC导向CAR与NKG2A阻断结合，可在感染细胞试图通过HLA-E/NKG2A轴抑制NK细胞活性时减少抑制信号；同时，当HIV特异性抗体或衔接子分子结合感染细胞时，靶标依赖性CD16结合可增强活化与细胞毒作用；这些机制共同可能有助于在病毒免疫逃逸情况下维持NK细胞活化。由于所提出的CAR与CD16衔接子均靶向HIV Env，对转录沉默储存库细胞的识别可能需要潜伏逆转或其他诱导足够Env表达的手段。该模型仍属理论性，需大量研究确定其可行性、安全性和抗病毒效力；未来研究需确定靶标依赖性CD16结合的最佳方法、NKG2A阻断最安全有效的方式、鉴定足够保守的HIV-1抗原或肽-MHC靶标用于CAR识别，并评估联合这些机制较单一方法是否改善感染细胞及持续病毒储存库的清除。此外，由于CAR-NK细胞工程属于过继性细胞免疫治疗而非疫苗接种本身，需进一步研究确定该策略如何与疫苗诱导的HIV特异性免疫整合；尽管如此，结合靶标依赖性CD16结合、NKG2A检查点阻断与HIV特异性CAR靶向，为研究互补性NK细胞介导机制能否协同用于推进HIV-1免疫治疗并为未来治疗性疫苗研发提供启示，提供了一个可检验的框架。
7. 7.
   结论
   尽管基于NK细胞的免疫治疗显示出前景，仍需更多研究确定其在HIV-1治疗与疫苗研发中的安全性、可行性及临床效力。NK细胞亚群在外周血中浓度不等，且并非均以相同特异性或细胞毒能力发挥作用；然而，iPSC来源CAR-NK细胞仍是颇具吸引力的平台，因工程化iPSC谱系可维持并扩增，可能为治疗开发提供可再生的NK细胞来源。总体而言，NK免疫治疗具有若干优势：NK细胞可从多种来源生成并扩增，包括外周血、脐带血、骨髓、NK-92细胞系及iPSC来源细胞；此外，NK细胞利用多种细胞毒途径清除病毒感染宿主细胞，为治疗探索创造机会。除直接细胞毒作用外，NK细胞与HIV特异性抗体配对时可介导ADCC；靶向HIV包膜蛋白保守结构表位的广谱中和抗体（bNAbs）可能进一步增强NK介导的ADCC；类似地，CAR-NK细胞可经工程化识别HIV Env上保守或易感表位，可能有助于克服糖基屏蔽等免疫逃逸机制。若干NK细胞介导通路可能与未来HIV-1免疫治疗及治疗性疫苗研发尤为相关：适应性与记忆样NK细胞可贡献抗原特异性应答，NKG2/HLA-E轴可影响病毒识别过程中NK细胞接受抑制或活化信号；靶标依赖性CD16结合、bNAb介导ADCC及HIV特异性CAR-NK方法可增强NK细胞对HIV感染细胞的活化、特异性与细胞毒作用；此外，白细胞介素-15（IL-15）超激动剂可通过促进NK细胞扩增、持续存在及细胞毒功能间接增强抗病毒活性。总之，基于NK细胞的策略本身并非疫苗，但可能通过改善HIV特异性免疫识别、储存库靶向及抗病毒效应功能为未来治疗性疫苗研发提供启示。尽管既往HIV疫苗策略成效有限，进一步研究适应性NK细胞及其独特功能特性可能为HIV-1免疫控制提供有价值见解；非人灵长类模型中的实验性SIV疫苗研究（包括病毒载体方法及记忆样NK细胞应答）提供重要线索，但尚未提供确定的疫苗模板或治愈方案。继续研究NK细胞介导免疫，尤其与靶标依赖性CD16结合、NKG2/HLA-E信号、bNAb介导ADCC、IL-15支持的NK细胞活化及HIV特异性CAR-NK平台相结合，可能推动该领域更接近开发出针对HIV-1的有效治疗与预防方法。