《Biology》：Haplotype-Resolved Chromosome-Scale Genome Assembly of Lonicera macranthoides Hand.-Mazz. Reveals Genetic Determinants of Bioactive Compound Biosynthesis and Phytohormone-Mediated Metabolic Regulation
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山银花（Lonicera macranthoides）是一种以绿原酸（chlorogenic acid, CGA）和三萜皂苷（triterpenoid saponins）为主要活性成分的传统药用植物。为阐明这些药用特性的遗传基础，研究人员结合Pa
山银花（Lonicera macranthoides）是一种以绿原酸（chlorogenic acid, CGA）和三萜皂苷（triterpenoid saponins）为主要活性成分的传统药用植物。为阐明这些药用特性的遗传基础，研究人员结合PacBio长读长测序（long-read sequencing）与高通量染色质构象捕获（High-throughput Chromosome Conformation Capture, Hi-C）数据，构建了单倍型分辨的染色体尺度基因组组装。该组装包含两个单倍型（haplome）：LmacA（857.17 Mb，contig N50 = 31.19 Mb）和LmacB（824.65 Mb，contig N50 = 27.17 Mb），是该属中连续性最高的基因组资源。比较基因组分析鉴定到在三萜生物合成、苯丙烷代谢（phenylpropanoid metabolism）和胁迫响应通路中显著富集的物种特异性基因家族。通过整合全基因组关联分析（Genome-wide association studies, GWAS）、转录组和代谢组数据，研究人员鉴定了调控CGA和三萜皂苷生物合成的关键基因，包括一个UDP-糖基转移酶（UDP-glycosyltransferases, UGT）簇、一个羟基肉桂酰转移酶（hydroxycinnamoyl-CoA shikimate and quinate hydroxycinnamoyl transferase, HCT）簇和MYB转录因子。研究进一步发现，茉莉酸（jasmonic acid, JA）和异戊烯基腺嘌呤（isopentenyl adenine, iP）通过MYB/bHLH转录因子和MAPK信号通路动态平衡花器官发育与次级代谢物积累。本研究首次建立了山银花中CGA和皂苷的生物合成通路，揭示了由单倍型结构变异（structural variation, SV；特别是Chr7倒位）驱动的调控机制，并为分子育种和活性化合物的开发提供了基因组资源。
**研究背景与科学问题**
山银花（
Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.）是传统中药材山银花（Lonicerae Flos）的基原植物，其花与花蕾在中医中应用历史悠久，具有抗炎、抗菌、抗氧化、保肝和抗癌等药理活性，主要归因于其次级代谢物，包括绿原酸（chlorogenic acid, CGA）、黄酮类、环烯醚萜和三萜皂苷（triterpenoid saponins）。其中，CGA是该植物中含量最丰富的活性成分，具有神经保护、抗炎、抗氧化等多种药理活性；与CGA相比，山银花积累的三萜皂苷浓度显著高于其他忍冬属（
Lonicera）物种，以hederagenin型皂苷为主，代表成分包括macranthoidin B、dipsacoside B和macranthoidin A。
尽管CGA与三萜皂苷的通用生物合成通路已较明确，但山银花物种特异性的生物合成通路及其调控机制在很大程度上仍不清楚。同时，花发育阶段和品种变异显著影响药材品质：封闭花蕾型品种虽适于栽培、便于采收，但CGA含量低且抗病性差；野生多花型品种遗传多样性高，却因花冠早开导致可采收花蕾产量低。该物种基因组具有高杂合率（1.36%）和高重复序列比例，且此前缺乏单倍型分辨的基因组组装，两个单倍型的差异表达、不对称进化及其对代谢物积累的作用均未被揭示。
**关键技术与方法**
本研究整合PacBio HiFi长读长测序与Hi-C数据，采用Hifiasm完成单倍型分辨的从头组装，利用3D-DNA与Juicebox挂载至染色体，以BUSCO（Benchmarking Universal Single-Copy Orthologs，通用单拷贝直系同源基准）和Merqury评估组装质量。比较基因组分析基于14个物种，采用OrthoFinder基因家族聚类、RAxML系统发育重建、MCMCTREE分歧时间估算、CAFE基因家族分析及PAML正选择检验，并以ksrates和4DTV检测全基因组复制（whole-genome duplication, WGD）事件。研究材料包括102份来自贵州绥阳的山银花自然群体（涵盖W、T、C三个品种类型），进行全基因组重测序（平均深度约12×），采用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）测定CGA与Dipsacoside B含量，利用GEMMA、EMMAX和rMVP开展全基因组关联分析（Genome-wide association studies, GWAS）；考虑到该群体连锁不平衡程度（r
2 ≈ 0.5 at 50 kb），采用p < 5 × 10
?8作为全基因组显著性阈值；对52个转录组文库进行DESeq2差异表达（differentially expressed genes, DEGs）分析；结合液相色谱-质谱联用（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS）非靶向代谢组与靶向植物激素检测；最后构建TO-GCN时序共表达网络解析激素调控网络。
**研究结果**
**3.1 基因组测序、组装与注释**
k-mer分析估算基因组大小为804.88 Mb，杂合率1.36%，重复序列49.67%。研究共获得88.09 Gb BGI短读长（109.4×）、66.48 Gb PacBio HiFi（82.6×）和76.43 Gb Hi-C（95.0×）数据。组装获得两个相位化单倍型：LmacA（857.17 Mb，contig N50 = 31.19 Mb，BUSCO 98.90%）与LmacB（824.65 Mb，contig N50 = 27.17 Mb，BUSCO 99.10%），97.55%的序列挂载至18条假染色体。Merqury k-mer完整度分别为80.36%与79.37%，switch error rates（相位转换错误率）分别为4.72%和5.08%，表明超过95%的相邻杂合位点被正确分型。注释鉴定到LmacA含36,792个蛋白编码基因、LmacB含36,433个基因，功能注释率均超90.80%；重复序列占基因组的65.38%（LmacA）与65.28%（LmacB），以长末端重复反转录转座子（Long Terminal Repeat retrotransposons, LTR retrotransposons）为主。非编码RNA注释共鉴定出13,490个（LmacA）和8,922个（LmacB）非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）基因。
**3.2 两个单倍型间的结构变异与染色体重排**
以LmacA为参考共鉴定出84,084个结构变异（structural variants, SVs），其中11,042个基因受SV影响，主要富集于GPI-anchor生物合成、鬼臼毒素（podophyllotoxin）生物合成、倍半萜与三萜生物合成、糖胺聚糖降解及淀粉和蔗糖代谢等通路。Chr7上发现大型倒位事件（LmacA中11.32 Mb/LmacB中9.78 Mb），涵盖2,710和2,080个基因，涉及MVK、MEKK1等基因家族，其在两个单倍型间的拷贝数与表达存在差异。
**3.3 基因组进化与基因多样化**
比较基因组分析鉴定出72,741个orthogroups（直系同源基因群），山银花拥有4,356个物种特异性基因家族，显著富集于多种植物次级代谢物生物合成、氰基氨基酸代谢及淀粉和蔗糖代谢通路。系统发育分析基于1,346个single-copy orthogroups（单拷贝直系同源群），显示山银花在忍冬属中分化最早，与
L. japonica约在32.5–56.6百万年前（Mya）分化；随后1,748个基因家族扩张、2,061个收缩。ksrates分析显示混合Ks分布存在Ks ≈ 0.74与1.73（WGT-γ）两个峰值，4DTV分析在约0.25处出现显著峰，与
L. japonica和
L. caerulea的模式相似，支持山银花近期发生全基因组复制（WGD）事件；正选择分析共鉴定出17个基因，富集于果糖和甘露糖代谢、泛醌及其他萜醌生物合成等通路。
**3.4 GWAS检测CGA和Dipsacoside B含量相关变异**
**3.4.1 CGA含量GWAS与转录组分析**
GWAS鉴定到4个与CGA含量相关的信号位点：CGA-3.1位点的OMT基因（LguiCGA1）、CGA-7.1位点的含11个HCT基因的簇、CGA-4.1和CGA-6.1位点的两个MYB转录因子。转录组关联分析显示，HCT簇基因LguiChr7AG00264170在W品种中与CGA含量关联最强（r = 0.87，p = 0.0023，n = 9）；该基因5种主要单倍型中HapII表现出最高的CGA中值含量。两个MYB基因在White、Silver、Yellow阶段高表达，提示其可能对CGA生物合成起负调控作用。
**3.4.2 Dipsacoside B含量GWAS与转录组分析**
DIP-4位点包含8个串联重复的UDP-葡萄糖基转移酶（UDP-glycosyltransferase, UGT）基因，其中LguiChr4AG00068810和LguiChr4AG00068820在所有测试组织中高表达，LguiChr4AG00068840和LguiChr4AG00068870与W品种Dipsacoside B积累呈正相关。研究鉴定的8个UGT直系同源基因多于先前报道的2个，表明组装完整性提高；不同UGT基因在不同品种中优势表达，可能由转录因子组合或表观遗传修饰驱动。
**3.5 发育阶段和品种特异性调控皂苷生物合成的糖基化通路**
四个靶向代谢物中仅Dipsacoside B和Macranthoidin B在品种或发育阶段间存在显著积累差异。W品种中Dipsacoside B在Yellow阶段较White和Green阶段显著降低（p = 0.026），C品种Bud阶段最高。W-White vs. W-Yellow与W-Green vs. W-Yellow比较分别鉴定10,316和12,912个DEGs，显著富集于糖基化相关通路；研究推测UDP2基因下调（LguiChr2AG00216330和LguiChr2BG00214870）与Dipsacoside B减少相关。W-Green vs. W-Silver比较显示，富集于GO:0016757（glycosyltransferase activity）的UGT基因在Silver阶段显著上调，可能竞争性地将三萜前体导向其他糖基化代谢物，与Macranthoidin B在Silver阶段最低相符；LguiChr4AG00091540在C-White中下调，可能减少竞争糖基化分支而促进Dipsacoside B积累。
**3.6 植物激素对花形态发育的影响**
靶向激素检测显示，茉莉酸（jasmonic acid, JA）和异戊烯基腺嘌呤（isopentenyl adenine, iP）与花冠开裂表型最吻合。W品种JA水平呈W > T > C的趋势；JAZ基因在W品种Green到White过渡中上调，JAR1_4_6和MYC2下调。iP在三个品种中自Bud至Green持续下降，W品种White阶段最低（约0.3 ng/mg），随后Yellow阶段急剧上升；W-White阶段HMGCR和HMGCS等甲羟戊酸（mevalonate, MVA）通路关键基因显著上调，为iP后续升高积累前体。TO-GCN时序共表达网络显示，W品种White到Silver转变涉及179个DEGs、54个转录因子及10种激素，其中72个结构基因受以MYB（6个）和AP2（4个）为主的22个TF调控，包括MAPK家族成员MPK7；T品种中17个结构基因参与iP和ABA合成，受bHLH TF（LguiChr7AG00273160）调控。
**讨论部分总结**
研究指出组装质量（连续性与BUSCO完整度）优于先前已发表的山银花基因组。HCT基因簇中多数拷贝转录沉默，表达的基因显示品种特异性，可能与HCT在CGA和木质素合成中的双重作用及底物竞争有关；与CGA含量关联最强的基因为LguiChr7AG00264170（r = 0.87，p = 0.0023）。研究提出糖基化（由UDP2和UGT介导）是皂苷生物合成的核心调控节点：W品种优先将UDP-葡萄糖分配给花冠开裂而减少后期皂苷合成，T品种平衡分配以维持后期皂苷积累，C品种因竞争UGT分支下调（如LguiChr4AG00091540）而有利于Dipsacoside B储存。JA与iP构成拮抗网络：JA促进花冠开放但拮抗皂苷储存，细胞分裂素前体iP调节发育节奏。研究人员强调，所有结果均为关联性证据，GWAS、转录组与代谢组的一致结果支持候选基因和通路，但不建立因果关系；所推断的调控关系有待通过基因敲除/过表达或激素处理等靶向功能实验验证。
**研究结论（翻译）**
综上所述，研究人员构建了山银花的单倍型分辨染色体尺度基因组组装，整合全基因组关联分析、转录组和代谢组数据，优先鉴定了与绿原酸和三萜皂苷积累及花发育相关激素调控相关的候选基因和通路。这些结果为未来机制研究和分子育种提供了有价值的基因组资源和一组可检验的假设。然而，所推断的调控关系仍需通过靶向功能实验加以验证。
