《Sensors》：Reflective and Transmissive Off-Axis Sub-THz Beam Shaping Using Passive Complementary Split-Ring Resonators
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唾液皮质醇与睾酮水平的同步测定可为人体生理状态提供互补信息。然而，多重免疫分析面临挑战，原因在于两种分析物处于不同浓度水平且相应的免疫化学试剂可能相互干扰。在本研究中，研究人员开发了一种用于皮质醇与睾酮同步比色测定的双重侧向流免疫分析（LFIA）。该检测构建于
唾液皮质醇与睾酮水平的同步测定可为人体生理状态提供互补信息。然而，多重免疫分析面临挑战，原因在于两种分析物处于不同浓度水平且相应的免疫化学试剂可能相互干扰。在本研究中，研究人员开发了一种用于皮质醇与睾酮同步比色测定的双重侧向流免疫分析（LFIA）。该检测构建于单一硝酸纤维素膜上，包含两个空间分离的竞争性免疫反应区。该免疫分析设计的显著特征在于两个检测线之间设置了一个选择性拦截区，其功能为免疫化学捕获区（immunochemical sink）。优化后的检测对皮质醇的线性范围为0.38–5.41 ng/mL，对睾酮为27–845 pg/mL，计算检测限分别为0.18 ng/mL和10.1 pg/mL。分析耗时20 min，可利用单一试纸条和比色信号处理实现两种信号的检测。对加标人工唾液样本的分析回收率为96.4–105.7%。结果表明，免疫化学反应的空间组织可作为一种多重LFIA的替代策略，适用于不宜使用光谱区分标记或各单项检测分析要求差异显著的情形。
研究背景方面，唾液作为无创检测类固醇激素的生物基质日益受到关注。与静脉采血相比，唾液采样简便、微创、适合重复测量且可在常规实验室环境之外进行。唾液中含有激素、细胞因子、酶、代谢物及免疫标志物等多种分析物，可用于识别系统性和局部性疾病及评估机体功能状态。唾液中类固醇激素浓度主要反映其游离循环部分，皮质醇的唾液-血清浓度比约为1:20（5%），睾酮约为1:90（1.1%）。然而，唾液生物标志物的定量分析仍面临分析挑战：唾液浓度显著低于血清，且测量可受采样时间、唾液流速、采集装置、进食、污染等分析前因素影响。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）可同时测定多种生物标志物，但需昂贵仪器、实验室基础设施、样品制备和专业人员，限制了其在分散检测中的应用。酶联免疫吸附测定（ELISA）和化学发光免疫分析（CLIA）成本较低、准确性高，适合常规实验室实践。即时检验（point-of-care testing）旨在减轻现代医疗系统负担并提供快速、无创的健康监测，其中侧向流免疫分析（LFIA）因其快速、低成本、无需昂贵设备且可与数字读取系统整合等优势而备受关注。多重LFIA检测系统对诊断和健康监测尤具吸引力，但开发面临挑战：唾液中大多数生物标志物浓度低，互补生物标志物的参考区间常相差数个数量级。因此，寻求保留即时检验膜检测全部优势并确保必要灵敏度及无潜在交叉反应的新架构方案是迫切的研究方向。本研究选择皮质醇和睾酮作为下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴活动的互补标志物，二者浓度关系可提供单一标志物无法可靠获得的内分泌状态信息，在运动医学和内分泌学中关于应激、疲劳、恢复、过度训练和适应性反应的研究中具有临床意义。然而，利用LFIA同时测定皮质醇和睾酮存在挑战：两种生物标志物具有不同的临床显著浓度范围，须在单一试纸条上测量。典型晨间唾液皮质醇浓度约为4 ng/mL，傍晚降至约1 ng/mL，而男性唾液睾酮浓度通常约为50–150 pg/mL。本研究提出一种LFIA，通过在共同硝酸纤维素膜上受控监测竞争性免疫反应实现皮质醇和睾酮的测定。为应对在不同浓度范围内检测两种目标分析物的挑战，提出了一种在两个检测线之间设置拦截区的新型试纸条设计。该配置确保两种竞争性免疫反应的空间分离，并在抗皮质醇单克隆抗体-金纳米颗粒复合物（CORT识别探针）到达睾酮检测区之前，在含抗物种抗体的拦截区内选择性去除该复合物。所开发的LFIA平台具有两个重要优势：由于免疫反应的空间分离，无需光谱区分标记或复杂多重检测设备；尽管两种免疫分析系统同时运行，仍可独立评估其分析性能。因此，两种生物标志物基于金纳米颗粒作为标记的同一比色原理检测，并从单一试纸条定量处理数据。
研究人员开展的研究方面，开发了用于皮质醇和睾酮同步比色测定的双重LFIA，构建于含两个空间分离竞争性免疫反应区的单一硝酸纤维素膜上，其显著特征为两个检测线之间的选择性拦截区。研究得出，优化后的检测对皮质醇工作范围为0.38–5.41 ng/mL，对睾酮为27–845 pg/mL，检测限分别为0.18 ng/mL和10.1 pg/mL，分析耗时20 min，加标人工唾液回收率为96.4–105.7%。其重要意义在于证明免疫化学反应的空间组织可作为多重LFIA的替代策略，适用于不宜使用光谱区分标记或各单项检测分析要求差异显著的情形。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员采用柠檬酸钠还原氯金酸合成直径约30 nm的金纳米颗粒（AuNPs），并通过吸收光谱、透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）进行表征；采用OPSS-PEG-NHS活化抗皮质醇（克隆LC-002）和抗睾酮（克隆XE-006）单克隆抗体，与AuNPs偶联制备识别探针；采用碳二亚胺法合成皮质醇-卵清蛋白（CORT-OVA） conjugate；在硝酸纤维素膜上依次固定CORT-OVA（检测线1）、羊抗小鼠抗体（GAMI，拦截区）、睾酮-BSA（检测线2）和Protein G（控制线2）制备双重侧向流免疫试纸条；以人工唾液为样本基质进行加标回收分析，并与参考ELISA法比对。
研究结果方面：3.1 金纳米颗粒与识别探针的表征——通过吸收光谱、TEM和DLS表征，AuNPs呈特征性局域表面等离子体共振峰525 nm，平均直径30.4 ± 3.1 nm，流体动力学尺寸35 ± 4 nm，表明胶体溶液无聚集、适合后续抗体功能化；识别探针制备后吸收带轻微红移（CORT为526 nm，TEST为529 nm），DLS显示流体动力学直径增至CORT识别探针78.8 ± 4.3 nm、TEST识别探针72.9 ± 5.6 nm，证实探针成功制备。3.2 双重侧向流免疫分析原理——传统竞争性LFIA在单一试纸条上利用单流同时检测两种激素，检测线1和2含分析物-蛋白 conjugate，无分析物时识别探针与捕获 conjugate结合形成两条红色检测线，有分析物时信号降低；由于两种激素临床相关浓度范围差异显著，本研究提出整合两个不同操作要求分析系统并防止分子探针交叉干扰的新型双重LFIA设计，其显著特征为拦截区，即固定抗物种抗体的区域，结合任何残留的CORT识别探针防止其到达下游睾酮检测区，而TEST识别探针可无阻碍通过拦截区参与睾酮检测反应；此外包含固定Protein G的控制线2，反映实际通过分析系统但未在检测线2结合的TEST识别探针量，随睾酮浓度增加检测线2结合减少而控制线2相应增加，两信号提供TEST识别探针在分析和控制区间分布的互补信息，确保两种免疫化学反应空间分离、实现两种分析物独立测定。3.3 拦截区评估——通过评估CORT识别探针在有和无拦截区试纸条上的迁移，发现无拦截区时残留CORT识别探针迁移至TEST-BSA固定区域并在检测线2观察到非特异性结合，表明对睾酮检测的潜在干扰；引入拦截区后CORT识别探针与固定抗物种抗体结合、阻止其进一步迁移至检测线2，且拦截区对CORT识别探针具选择性而TEST识别探针不与抗物种抗体结合、特异性与检测线2上TEST-BSA conjugate相互作用；两种识别探针和分析物同时存在时，拦截区确保组分空间分离，证实单一膜上进行两种竞争性免疫化学反应的可行性；分析标准溶液显示含拦截区时睾酮检测限为0.06 ng/mL，无拦截区时为0.4 ng/mL，高皮质醇低睾酮条件下交叉干扰从13.8%降至3.4%；新试纸条架构使皮质醇工作范围从0.03–0.6 ng/mL移至0.3–3.9 ng/mL，与唾液中该生物标志物参考值一致，且未导致变异系数或交叉干扰值增加；后续研究补充固定Protein G的控制线2，试纸条设计自下而上为检测线1（CORT-OVA）、拦截区（GAMI）、检测线2（TEST-BSA）和控制线2（Protein G）。3.4 双重LFIA优化——通过监测两种检测系统的比色响应，改变唾液稀释缓冲液组成、识别探针光密度、识别探针中抗体浓度及硝酸纤维素膜上固定免疫试剂浓度进行优化，选择标准为两种目标物在无和有分析物时信号比最大；缓冲液组成对睾酮检测系统影响最显著，选择PBS为最优缓冲液；识别探针光密度增加导致无分析物时信号增加，CORT和TEST识别探针光密度分别为5和4时信号振幅最大；AuNP功能化最优抗体浓度两系统均为10 μg/mL；固定 conjugate较高浓度导致有分析物时背景信号增加，选定Ova-CORT 0.5 mg/mL和BSA-TEST 0.25 mg/mL为最优固定浓度；比较控制线2信号确定Protein G最优浓度为0.05 mg/mL；以含CORT识别探针样本通过时检测线2完全无信号为选择标准，确定拦截区GAMI最优固定浓度为0.5 mg/mL。3.5 双重LFIA分析性能——分别评估各分析物分析特性，皮质醇检测线1信号随浓度增加而降低，拦截区强度在研究范围内几乎不变，故直接以检测线1强度作为定量分析信号，检测限0.2 ng/mL、工作范围0.42–5.36 ng/mL；睾酮检测线2强度随浓度增加逐渐降低，但控制线2强度也随睾酮浓度增加而增加，故不宜作为标准参考信号，采用检测线2/控制线2强度比作为睾酮定量分析参数，该归一化方法产生更显著的浓度-响应关系并提高灵敏度，工作范围38.4–1259 pg/mL、检测限13.8 pg/mL；两种免疫分析虽结合于单一双重LFIA格式但采用不同信号处理方式；同时测定时优化双重LFIA对皮质醇工作范围0.38–5.41 ng/mL、睾酮27–845 pg/mL，检测限分别为0.18 ng/mL和10.1 pg/mL，与单分析物检测分析性能相当，证明两种免疫化学反应在单一膜上成功分离；验证可靠性显示双重LFIA在同时运行中维持两分析系统响应，恒定浓度组分信号重现性高，睾酮和皮质醇比色响应标准差分别为2.8%和4.6%。3.6 特异性——在雌二醇、孕酮、可的松和脱氢表雄酮硫酸盐（DHEA-S）等潜在干扰类固醇激素存在下评估比色响应，其他激素未引起比色信号显著降低，证实检测特异性。3.7 双重LFIA实际应用性——以含1 ng/mL皮质醇和50 pg/mL睾酮的人工唾液样本评估重现性，批内重现性（同批10条试纸条）皮质醇和睾酮相对标准偏差（RSD）分别为4.5%和5.3%，批间重现性（3个不同批次）RSD分别为6.7%和6.1%，表明重现性优良；加标人工唾液样本分析回收率皮质醇96.4–105.7%、睾酮96.9–102.8%，与参考ELISA法结果高度一致；与近期LFIA方法比较，所提出的双重LFIA利用单一试纸条和传统比色读取实现同时定量测定，兼具高分析性能与易用性。讨论部分总结：现代多重免疫色谱分析发展可分为物理分离流中分析和单一试纸条单流内分析两大策略。利用分离试纸条或独立流通道的多重LFIA设计提供高度物理分离和独立优化可能，但增加装置复杂性、需额外试纸条或通道及更复杂样品分配系统；单膜单流多重LFIA保留传统LFIA优势，但流动条件下免疫化学反应以非平衡模式进行可影响各分析物分析性能，改变结合区排列显著影响检测限，用空间分离斑点或微阵列替代线性检测区可增加多重化水平但不提供对识别试剂转移的选择性控制，将多种识别试剂置于单一检测区并使用光谱区分标记则对信号读取和设备提出额外要求。本研究提出的双重LFIA设计代表单膜架构内的不同方法，两个检测线间引入拦截区将标准单流内顺序多重LFIA转化为功能分离系统，与先前多重LFIA检测相比保留单硝酸纤维素膜系统的紧凑性和视觉简洁性及传统金纳米颗粒检测方法，同时确保空间选择性防止识别探针间交叉干扰。研究结论部分翻译：本研究设计了一种双重侧向流免疫分析，其在皮质醇和睾酮反应区之间设置拦截区。该区域选择性去除残留CORT识别探针，同时允许TEST识别探针到达后续反应区，从而最小化单一膜上同时进行的免疫反应组分间的交叉干扰。在优化条件下，双重侧向流免疫分析能够在与评估内分泌状态相关的浓度范围内定量测定人工唾液中的皮质醇和睾酮。同时测定时，皮质醇工作范围为0.38–5.41 ng/mL，睾酮为27–845 pg/mL，检测限分别为0.18 ng/mL和10.1 pg/mL。所开发的检测系统在雌二醇、孕酮、可的松、泼尼松和DHEA-S等潜在干扰类固醇激素存在下也表现出特异性。加标人工唾液分析回收率皮质醇为96.4–105.7%、睾酮为96.9–102.8%，与参考ELISA法结果良好一致。总之，这些发现表明，免疫化学反应的空间组织结合干扰识别探针的捕获，为开发多重侧向流免疫分析提供了一种实用方法，尤其适用于分析物浓度范围差异巨大且偏好使用单一比色标记的情形。所提出的设计保留了单一膜金纳米颗粒侧向流免疫分析的简便性，同时减少识别探针间交叉干扰并消除对光谱区分标记的需求。
