Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr. 根茎采后腐烂过程中内生真菌群落演替及哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的生物防治潜力

《Agronomy》：Endophytic Fungal Dynamics During Postharvest Rhizome Decay of Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr. and the Biocontrol Potential of Trichoderma harzianum

　　

Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr. 是一种常用于中医药的攀援植物，其主要生物活性化合物集中于根茎。Rhizome rot（根茎腐烂病）是A. cochinchinensis的主要病害，在繁殖、采后及贮藏期均可侵染植株。研究人员利用高通量测序（High-throughput sequencing）和分离培养技术鉴定致病性真菌。来自无症状与有症状根茎的扩增子（Amplicon）序列分析表明，无症状根茎内生真菌群落的丰富度（Richness）和多样性指数（Diversity index）显著高于有症状根茎（p < 0.05），提示根茎腐烂发生过程中真菌群落组成发生演替。研究人员分别从无症状和有症状根茎中鉴定出32株和51株真菌分离物。其中，Aspergillus niger、A. flavus、Penicillium venetum、P. crustosum、Fusarium equiseti、F. oxysporum、Irpex lacteus和Chaetomium globosum在两类根茎中均为共有；而Neodeightonia subglobosa、Neurospora tetrasperma、Trichoderma harzianum、Talaromyces pinophilus和A. terreus仅在症状根茎中被检测到。重要的是，从症状根茎中分离的T. pinophilus、T. harzianum、A. terreus、N. tetrasperma和I. lacteus不具致病性，而其余八个种——A. niger、A. flavus、P. venetum、P. crustosum、F. equiseti、F. oxysporum、N. subglobosa和C. globosum——均能在Asparagus cochinchinensis中诱导显著的根茎软腐症状。任意两种（A. niger、F. equiseti和P. venetum）共接种后7天（dpi）显著加剧软腐发展（p < 0.05）。值得注意的是，T. harzianum在双培养试验中对A. niger、F. equiseti和P. venetum表现出生物防治活性，同时对镰刀菌枯萎病（Fusarium wilt）也表现出强烈抑制作用，提示可将T. harzianum作为防控天门冬根茎腐烂和枯萎病的潜在生防菌（Biocontrol agent）。数据表明，A. cochinchinensis根茎的内生真菌群落包含致病性、非致病性和益生菌真菌。该研究为理解A. cochinchinensis根茎腐烂病及开发靶向生防策略提供了微生物学基础。

天门冬（Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr.）为传统中药，根茎富含皂苷等活性成分。根茎腐烂病（Rhizome rot）是其主要病害，在繁殖、采后及贮藏期均可发生。尽管镰刀菌属（Fusarium）等可侵染近缘种，但针对A. cochinchinensis的病原鉴定与生防研究仍有限。因此，研究人员系统解析了根茎腐烂过程中的内生真菌群落演替规律，并评估了哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的生防潜力，以期为靶向生防策略提供依据。

研究人员以采自四川省内江市农业科学研究院的‘Neijiang’品种植株为对象，结合高通量测序（High-throughput sequencing）与形态学、多基因系统发育分析，比较了无症状与有症状根茎的群落结构，分离鉴定83株真菌，并通过单接、混接及盆栽试验明确致病与非致病种类及其互作效应。结果表明，无症状根茎的真菌丰富度（Richness）与多样性（Diversity）显著高于有症状根茎；F. oxysporum、F. equiseti、A. niger等8个种具有致病性，而T. harzianum等5个种为非致病性内生真菌。任意两种强致病菌共接种可显著加剧根茎软腐，本土分离的T. harzianum在离体及活体条件下均表现出显著拮抗与生防效果。该研究揭示了根茎腐烂过程中的群落演替规律，证实T. harzianum可作为防控根茎腐烂与枯萎病的潜在生防菌（Biocontrol agent）。

本研究主要采用ITS扩增子测序（ITS amplicon sequencing）技术，利用通用引物ITS1F/ITS2R对样本进行真菌群落分析，经QIIME2（Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2）平台降噪、ASV（Amplicon sequence variant）注释及Mothur软件进行alpha多样性（Alpha diversity）分析。同时，通过组织分离法获得纯培养，采用ITS与nLSU（nuclear ribosomal DNA large subunit）序列构建邻接树（Neighbor-joining tree）并结合形态学完成种级鉴定。病原性测定采用伤口接种法；采用双培养法（Dual-culture test）测定T. harzianum拮抗能力；并通过盆栽试验评估其对F. equiseti所致幼苗枯萎病的防效。样本来源于四川省内江市农业科学研究院采集的‘Neijiang’品种植株根茎。

3.1. 无症状与有症状根茎的真菌群落分析（Fungal community analysis）
对8个样本进行ITS扩增子测序，共获得789个ASV。Chao1丰富度指数和Shannon多样性指数分析表明，无症状根茎的真菌群落丰富度和多样性显著高于有症状根茎（p < 0.05）。有症状组中镰刀菌属（Fusarium）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）等为优势菌，而无症状组以Incertae sedis、Wallemia等为主。

3.2. 无症状与有症状根茎真菌分离与鉴定（Fungal isolation and identification）
通过PDA培养基共分离获得83株真菌，其中无症状组32株、有症状组51株。经ITS与nLSU联合序列构建邻接树并结合形态学，鉴定到13个真菌种。黑曲霉、黄曲霉、Penicillium venetum、P. crustosum、F. equiseti、F. oxysporum、Irpex lacteus和Chaetomium globosum在两类根茎中均有分布；Neodeightonia subglobosa、Neurospora tetrasperma、Trichoderma harzianum、Talaromyces pinophilus和A. terreus仅在症状根茎中检出。ITS和nLSU尚不足以在镰刀菌属和曲霉属复杂种内实现确切种级划分，部分结果仅代表系统发育上最接近的参考种。

3.3. 症状根茎来源真菌的病原性（Pathogenicity）
对13个分离菌株进行伤口接种测定，结果表明黑曲霉、黄曲霉、Penicillium venetum、F. equiseti、F. oxysporum、P. crustosum、N. subglobosa和C. globosum均可诱导根茎软腐，其中黑曲霉致病力最强，病情指数达88.11。黄曲霉在接种后7天（dpi）发病率即超过14.58%，15天（dpi）时黑曲霉、黄曲霉及Penicillium venetum等所致腐烂发病率均达96%以上。而T. harzianum、T. pinophilus、A. terreus、N. tetrasperma和I. lacteus不引起任何可见症状。

3.4. 双真菌病原性试验（Dual fungal pathogenicity assays）
选择致病力最强的A. niger、F. equiseti和P. venetum进行成对接种试验。结果显示，在接种后7天（dpi），任意两菌共接种的腐烂发病率与病情指数均显著高于单接种处理；至15天（dpi）时所有处理腐烂发病率均达100%。这表明病原菌协同侵染可显著加速根茎腐烂进程。

3.5. T. harzianum对软腐病原菌的抑制作用（Inhibitory effect of T. harzianum）
双培养试验表明，本土分离的T. harzianum在培养5天后对F. equiseti、A. niger和P. venetum的抑制率分别达73.49%、40.34%和37.56%，且其生长速率显著高于三种病原菌，显示出强烈的离体拮抗活性。

3.6. T. harzianum对F. equiseti所致幼苗枯萎病的生物防治效果（Biocontrol of seedling wilt）
盆栽试验结果表明，接种F. equiseti后幼苗表现出典型的叶尖失绿与萎蔫症状，病情指数达26.33。预先接种本土T. harzianum可显著延迟并减轻该症状，病情指数降至17.33，防效为34.73%；商业制剂T. harzianum防效为21.17%，表明本土菌株具有优于商业制剂的生防潜力。

讨论部分指出，内生真菌可在无症状根茎中定殖并在特定条件下转为致病态，病原菌丰度增加与镰刀菌、曲霉属等富集可能是群落多样性下降与腐烂发生的关键。非致病性内生真菌如T. harzianum在病害胁迫下的富集符合“诱导性拮抗微生物积累”理论，可通过重寄生（Mycoparasitism）、抗生（Antibiosis）、产生次级代谢产物及诱导系统抗性抑制病原。T. harzianum对F. equiseti的离体与活体防效提示其应用前景，盆栽试验的处理间差异可能与宿主防御异质性有关。复合采样可能掩盖个体变异，未来需结合单根采样深入解析。

研究结论（Conclusions）指出：天门冬发生根茎腐烂时，无症状根茎内生真菌群落的丰富度和多样性显著高于有症状根茎。真菌病原以无性内生形式存在于无症状根茎中，并可在条件适宜时转为致病。多种非致病性微生物在天门冬根茎定殖，具有抑制病原的潜力。生防菌T. harzianum应施用于已定植天门冬幼苗周围的基质中，以实现根茎腐烂与枯萎病的靶向防控。