《Agronomy》：Integrated Physiological and Transcriptomic Analyses Reveal Multilayered Cold Tolerance Responses in Alfalfa
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冷胁迫限制了紫花苜蓿（Medicago sativa L.）的生产，然而与不同品种耐寒性相关的生理和转录差异尚未完全阐明。本研究通过生理学、生物化学和转录组学分析，对一冷敏感品种（CS）和一耐寒品种（CT）进行了比较。经冷驯化后，CT表现出显著高于CS的冻存存
冷胁迫限制了紫花苜蓿（Medicago sativa L.）的生产，然而与不同品种耐寒性相关的生理和转录差异尚未完全阐明。本研究通过生理学、生物化学和转录组学分析，对一冷敏感品种（CS）和一耐寒品种（CT）进行了比较。经冷驯化后，CT表现出显著高于CS的冻存存活率（91.67% vs. 4.17%，p < 0.05）以及显著更低的电解质渗漏率（p < 0.05）。在4°C处理7天后，与CS相比，CT的丙二醛含量显著更低，而脯氨酸含量、抗氧化酶活性、叶绿素含量及光系统II（PSII）光化学效率显著更高（p < 0.05），同时活性氧（ROS）相关染色信号更弱。RNA-seq鉴定出CS在冷处理2小时和26小时后分别有711个和8763个差异表达基因（DEGs），而CT则分别有663个和12009个。这些基因与光合作用、碳水化合物与能量代谢、抗氧化过程、膜脂代谢、激素信号转导及转录调控相关。品种与时间互作分析分别在2小时和26小时鉴定出188个和226个在两品种间表达变化存在显著差异的基因（校正后p < 0.05）。这些发现揭示了冷暴露期间品种依赖性的转录轨迹及其对比鲜明的生理响应，并为研究紫花苜蓿耐寒性提供了候选基因。
研究背景与科学问题
紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是全球最重要的多年生豆科牧草之一，种植面积约3000至3500万公顷，因其高生物量、优质蛋白及固氮能力而在畜牧业和可持续农业系统中价值显著。然而，低温胁迫严重制约其生长、越冬能力及草地持久性，尤其在高纬度及温带地区。冷胁迫会破坏细胞膜完整性、诱发脂质过氧化与活性氧（ROS）积累、损害光合性能，并扰乱碳水化合物、脂类及激素代谢平衡。尽管植物可通过冷驯化获得增强的冻耐受性，该过程涉及复杂的生理生化及转录重编程，但不同耐寒性品种间的分子与生理差异仍未完全阐明。为此，本研究选用一冷敏感品种（CS）‘Sardi 10’与一耐寒品种（CT）‘Spyder’，从生理、生化及转录组水平系统比较其对冷胁迫的响应差异，旨在揭示耐寒性相关的关键保护机制及候选基因。
主要技术方法概述
研究人员采用以下关键技术：1）冻耐受性评估：通过电导率法测定相对电解质渗漏率（REC）及冻存存活率评价膜损伤程度；2）生理生化指标测定：包括丙二醛（MDA）含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）及谷胱甘肽还原酶（GR）活性、叶绿素荧光参数（Fv/Fm）及ROS组织化学染色（DAB/NBT）；3）转录组测序（RNA-seq）：对两个品种在4°C处理0、2及26小时的叶片进行链特异性cDNA文库构建及Illumina测序，数据比对至‘新疆大叶’参考基因组，利用DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs），并进行Gene Ontology（GO）与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析及品种-时间互作分析。
研究结果
3.1 冷敏与耐寒紫花苜蓿品种对冷胁迫的生理生化响应
冷驯化后，CT的冻存存活率达91.67%，远高于CS的4.17%。在-2至-8°C范围内，CT的相对电解质渗漏率（REC）均显著低于CS，尤其在-8°C时CT仅为15.25%而CS高达50.63%，表明CT能更好地维持膜完整性。冷处理7天后，CT的MDA含量比CS低21.2%，而脯氨酸含量显著更高。DAB与NBT染色显示CT的ROS积累明显弱于CS。CT在冷处理3天和7天的SOD活性、以及7天的APX和GR活性均显著高于CS。此外，CT的叶绿素a含量及PSII最大光化学效率（Fv/Fm）下降幅度小于CS（5.6% vs. 13.7%），表明其光合系统受损较轻。
3.2 转录组测序及冷响应DEGs鉴定
RNA-seq共获得171,187个基因，其中66.80%在所有样品中表达。在CS中，冷处理2小时和26小时分别鉴定出711个和8763个DEGs；在CT中则分别为663个和12009个。两品种在2小时共享260个DEGs，在26小时共享6045个DEGs，同时存在大量品种特异性DEGs，暗示品种依赖性转录调控与其耐寒性差异相关。
3.3 CT与CS冷暴露期间转录响应的差异
品种-时间互作分析鉴定出127个基因具有显著的总体互作效应。时间特异性检验发现，在2小时和26小时分别有188个和226个基因的表达变化在两品种间存在显著差异（校正后p < 0.05）。其中32个（2小时）和52个（26小时）非冗余候选基因通过了复现性与敏感性筛选，表明CT与CS在冷暴露过程中表现出不同的转录轨迹。
3.4 GO富集分析揭示共享与品种特异的冷响应过程
GO分析显示，两品种DEGs均富集于叶绿体、光合膜、光系统II等细胞组分，以及胁迫应答、渗透胁迫、激素响应、碳水化合物代谢等生物学过程。CT在2小时特异富集了温度响应、红光响应、叶绿素代谢、ROS相关过程、类黄酮代谢、光合作用及氧化应激响应等过程，提示其早期启动了更广泛的光合与防御相关转录重编程。
3.5 KEGG富集分析揭示冷胁迫下的动态通路调控
KEGG分析表明，2小时时两品种共同富集了光合作用、昼夜节律-植物、淀粉与蔗糖代谢及类胡萝卜素生物合成等通路，而光合天线蛋白通路仅在CT中特异富集。26小时时，共31条通路显著富集，涵盖能量代谢、碳水化合物、氨基酸、脂类及次生代谢物生物合成与信号转导。CT在多数通路中含有更多DEGs，但昼夜节律-植物与类黄酮生物合成通路中两品种DEG数目相当。
3.6 冷胁迫诱导光合作用相关基因的差异调控
冷胁迫影响了光系统II（PSII）核心亚基（psbA、psbB、PsbO等）、光系统I（PSI）（psaB、PsaD等）、细胞色素b6/f复合体（petA、PetF等）及ATP合酶（beta）编码基因的表达。值得注意的是，编码捕光复合体（LHC）蛋白的LHCA与LHCB家族基因在26小时普遍下调，且CT中下调的LHC基因数量多于CS。
3.7 冷胁迫重塑淀粉与蔗糖代谢相关基因
冷胁迫诱导了海藻糖合成（TPS/TPP）、蔗糖合成（SPS3、SUS2）相关基因上调，而蔗糖降解（MalZ、CWINV、VCINV）基因下调。淀粉降解相关基因（ISA3、AMY3、BAM1、BAM3、STP-1、PHS2）表达上升，而淀粉合成基因（SS3）表达下降。CT中碳水化合物代谢相关DEGs数量更多，提示其可能具有更强的渗透调节与代谢稳态维持能力。
3.8 冷胁迫转录重塑糖酵解、三羧酸循环及氨基酸代谢
糖酵解关键酶（PFK3、FBA5、GAPC、PK等）基因上调，而糖异生基因（FBP）下调。三羧酸循环（TCA）中MDH2、IDH1、ACO上调，而丙酮酸脱氢酶（PDHA/B）及ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）下调。同时，谷氨酸脱氢酶（GDH3）与丙氨酸氨基转移酶（AlaAT2）被诱导，提示碳氮代谢之间存在协调响应。
3.9 冷胁迫转录调控谷胱甘肽、脯氨酸及多胺代谢
谷胱甘肽合成（GSH1、GSH2）、再生（GPX、DHAR2、GR）及谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）基因上调。脯氨酸合成关键酶（P5CS、P5CR）表达增加，多胺合成（ADC1、SPDS1）与分解（PAOs）相关基因也差异表达，共同参与氧化还原平衡与渗透调节。
3.10 冷胁迫诱导脂质代谢相关基因的转录变化
磷脂酸（PA）/二酰甘油（DAG）代谢相关基因（LPAAT3、PLC、PLD、DGK2、PAP1/2）及磷脂酰甘油合成基因（PGS1）差异表达。磷脂合成（CHK、PCYT1、LPCAT1）基因上调，水解（LCAT3、GDPD5）基因下调。叶绿体膜脂代谢中，半乳糖脂合成（MGD2、DGD2、SFR2）及硫代异鼠李糖甘油二酯合成（SQD2）基因被诱导，其中DGD2与SFR2在CT中表达更高。
3.11 冷胁迫调节激素生物合成与信号转导相关基因
脱落酸（ABA）合成限速酶NCED1上调，但多数ABA合成基因下调，信号组分（PP2Cs、SnRK2、ABF2/4）上调。乙烯合成（SAMS、ACS1、ACO1）及信号（ETR1、EIN3）基因上调。细胞分裂素（CK）降解（CKXs、UGT73Cs）基因上调而信号组分下调。油菜素内酯（BR）与赤霉素（GA）合成及信号基因普遍下调，GA失活基因（GA2ox）上调。生长素（IAA）合成（YUC6/8）与结合（GH3.1/10）基因上调，但转运与受体基因下调。茉莉酸（JA）合成基因（AOS1/2、OPR3、ACXs）上调，而修饰基因（JMT、JAR4/6）下调，JAZ/TIFY反馈调节基因上调。
3.12 冷胁迫诱导早期信号与转录调控因子响应
钙信号相关基因（CNGCs、CaM/CMLs、CBLs、CIPKs、CDPKs/CPKs）及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联组分（RLKs、MAPKKKs、MKKs、MPKs）差异表达。转录因子（TFs）方面，CT中冷响应TFs总数（2小时69个，26小时330个）多于CS（62个，233个），其中AP2/EREBP-DREB亚家族在CT中上调更为显著，NAC、bHLH、MYB、HSF、bZIP、GRAS、C2H2及BES1家族在CT中也检测到更多冷响应成员。
讨论与结论
讨论部分指出，CT通过更强的抗氧化能力（SOD、APX、GR活性及谷胱甘肽代谢基因上调）和脯氨酸介导的渗透调节，有效降低了冷诱导的膜损伤（MDA及REC更低）。光合性能方面，CT维持了更高的叶绿素含量与Fv/Fm，其LHC基因更大幅度的下调可能有助于缓解光抑制。碳水化合物与能量代谢的转录重编程（如海藻糖、蔗糖合成增强及淀粉降解加速）为渗透保护和能量供应提供了底物。脂质代谢中，PA/DAG信号及叶绿体膜脂重塑（特别是DGD2、SFR2的高表达）可能与膜稳定性维持有关。激素网络呈现复杂调控：ABA与乙烯通路激活，而GA、CK、BR通路受抑，IAA与JA通路双向调节，共同协调防御与生长的平衡。早期钙信号与MAPK级联的激活以及众多TF家族（尤其是DREB亚家族）的差异表达构成了冷信号传导与基因表达重编程的核心。
研究结论：本研究揭示了冷敏感与耐寒紫花苜蓿品种在冷暴露期间的生理与转录组差异。耐寒品种表现出更低的膜损伤与氧化伤害、更高的脯氨酸积累与抗氧化酶活性，以及更好的光合性能维持。转录组分析鉴定了与代谢、氧化还原调控、膜脂、光合作用、激素信号及转录调控相关的冷响应基因。品种-时间互作分析进一步证明了两品种间表达变化的显著差异。这些发现为理解紫花苜蓿耐寒性机制及探索改良靶点提供了候选基因资源。
