《Analytica Chimica Acta》：High-Throughput Direct Glycosylation Analysis of Monoclonal Antibody Pharmaceutical Products by Taylor–Aris Dispersion Assisted ESI-MS
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单克隆抗体（mAb）药物产品的糖基化模式分析是生物制药研发与质量控制中的关键环节。本研究展示了一种无需任何样品前处理的快速电喷雾电离质谱（ESI-MS）检测方法，用于mAb糖基化模式分析。研究人员系统评估了不同的流动条件，以优化检测灵敏度与分析速度。通过合理调
单克隆抗体（mAb）药物产品的糖基化模式分析是生物制药研发与质量控制中的关键环节。本研究展示了一种无需任何样品前处理的快速电喷雾电离质谱（ESI-MS）检测方法，用于mAb糖基化模式分析。研究人员系统评估了不同的流动条件，以优化检测灵敏度与分析速度。通过合理调控流动参数，实现了极低的样品消耗量（53 nL）、快速分析时间（3分钟以内）以及良好的检测灵敏度。Taylor–Aris分散辅助ESI-MS（TADA-MS）作为一种快速高效的工具，适用于常规糖型分析，并可作为mAb药物生产过程中的有效在线控制手段。
论文解读文章
一、研究背景与目的
单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）因其对单一靶抗原的高度特异性识别与结合能力，在肿瘤、自身免疫性疾病等的诊断与治疗中具有广泛应用。蛋白质在合成后可发生多种翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs），其中N-糖基化是mAb最主要的翻译后修饰形式，对蛋白质结构的稳定性、药代动力学和药效学特性均具有显著影响。糖基化模式的变化，如核心岩藻糖基化的缺失、半乳糖基化或唾液酸化的改变，与受体结合增强、构象开放及稳定性降低等密切相关。因此，糖基化被认定为mAb治疗性药物质量的关键质量属性（critical quality attribute, CQA）。
在生物制药研发与质量控制中，对mAb产品中各类变异体的检测与定量尤为重要。完整质量水平的质谱分析（intact mass spectrometry）因所需样品处理最少、分析速度快、能保留内源性修饰并降低前处理过程中的降解风险等优势，成为一种重要的快速分析表征技术。电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS）可产生多电荷离子，使大分子生物药物在较低的质荷比（m/z）范围内以较高分辨率被分析，质量误差可低于20 ppm。然而，在ESI-MS测量前通常仍需采用在线或离线分离/分级策略，以确保完整蛋白以纯化形式进入质谱仪，避免基质组分的干扰。
近年来，研究人员开发了Taylor–Aris分散辅助电喷雾质谱（Taylor–Aris dispersion-assisted ESI-MS, TADA-MS）技术，用于缓解大分子生物药物质谱分析中常见的严重基质干扰效应。该技术利用蛋白质与样品中基质组分（如盐类）之间扩散系数的显著差异，在层流抛物线流速分布与径向扩散的联合作用下，实现样品塞中不同尺寸分子的轴向分散差异，从而使大分子蛋白与小分子基质发生部分分离。TADA-MS特别适用于天然蛋白质分析，允许分析物在磷酸盐缓冲液（PBS）等更接近天然状态的条件下直接进样。
本研究旨在证明TADA-MS能够实现制药工业中mAb最常规的重要分析之一：无需任何样品制备或净化，通过直接进样即可完成药物产品的完整质量测量与糖基化谱分析。同时，研究人员评估了针对TADA-MS测量专门优化的不同流动条件，重点关注检测灵敏度与分析时间的优化。
二、主要技术方法
研究人员使用配备三轴CE-ESI接口（G1607B, Agilent）的maXis II UHR ESI-QTOF质谱仪（Bruker），以CE仪器（7100型，Agilent）完成样品的注入与输送。实验采用三种不同的流动条件（A、B、C）：条件A采用50 μm内径、60 cm长的熔融石英毛细管，以0.1 bar压力、5 μL/min鞘液（sheath liquid, SL）流速运行，样品体积53 nL，驻留时间6.8分钟；条件B采用50 μm内径、120 cm长毛细管，1 bar压力，样品体积120 nL，驻留时间2.7分钟；条件C采用100 μm内径、300 cm长毛细管，1 bar压力，鞘液流速降至1 μL/min，样品体积2700 nL，驻留时间4.3分钟。所有条件下Péclet数（Pe）和量纲为一的驻留时间（τ）均满足Taylor分散的判据要求（Pe > 69，τ > 1.4）。样品通过CE仪器的压力系统以水为输送液体进行水动力注入和迁移。质谱数据通过Bruker Compass DataAnalysis软件处理，并使用Bruker Maximum Entropy Deconvolution软件进行质谱去卷积。研究分析了来自不同制造商的10种mAb药物产品，包括Atezolizumab（Tecentriq?）、Bevacizumab（Avastin?）、Pertuzumab（Perjeta?）、Rituximab（Mabthera?）（均来自Roche）、Cetuximab（Erbitux?）（来自Merck KGaA）、Ipilimumab（Yervoy?）和Nivolumab（Opdivo?）（均来自Bristol Myers Squibb）、Panitumumab（Vectibix?）（来自Amgen）、Ramucirumab（Cyramza?）（来自Lilly）以及Trastuzumab（Ontruzant?）（来自Samsung Bioepis）。样品在5°C下储存，未经稀释直接进样。
三、研究结果
3.1 TADA-MS信号获得的质谱
研究人员通过提取离子色谱图（extracted ion chromatogram, EIC）展示了含Cetuximab药物产品的典型TADA-MS测量强度分布。ESI-MS信号在样品塞的前沿和后沿区域显著高于中间区域，这是因为中间区域存在低分子量基质组分的强烈干扰。样品塞后沿区域虽也能获得清晰的mAb谱图，但信号强度略低；某些样品中后沿区域信号强度显著降低，可能因部分干扰基质组分吸附拖尾并与mAb后沿部分一同洗脱所致。因此，后续实验仅使用样品塞的前沿部分进行质谱检测。
3.2 高通量或高灵敏度TADA-MS的流动条件
研究人员基于Taylor分散判据和ESI稳定运行需求，设计了三种流动条件以分别满足低样品消耗、快速分析和较高检测灵敏度的需求。条件A（低样品消耗模式）使用小内径毛细管和低迁移流速，样品体积仅53 nL，需借助鞘液维持ESI稳定运行，鞘液流速约为样品流速的25倍，因此进入质谱仪的溶液pH和溶剂组成主要由鞘液决定。在酸性鞘液条件下，mAb质谱中以高电荷态形式为主，信号强度约为天然条件下（25 mM乙酸铵鞘液）的6倍，去卷积谱图相似，故后续实验采用变性鞘液。条件B（快速分析模式）使用小内径毛细管和高迁移流速，驻留时间仅2.7分钟，低电荷态形式更为显著，最大强度与高电荷态形式相当。条件C（高灵敏度模式）采用100 μm内径毛细管和5.5 μL/min的高样品流速，获得最高的最大信号强度。三种条件下获得的去卷积谱图糖基化模式高度相似，均检测到约15种糖基化蛋白形式。10种mAb药物产品在三种条件下均表现出非常相似的结果。
3.3 mAb的TADA-MS分析
研究人员对10种不同mAb药物产品进行了去卷积完整质谱分析。大多数抗体的糖基化谱以岩藻糖基化N-聚糖为主，伴有不同程度的半乳糖基化，这与所有mAb均在CHO表达系统中生产的事实相符，也与文献报道的糖型数据一致。Atezolizumab是唯一缺乏N-连接糖基化的mAb，因其重链第298位天冬氨酸被有意替换为丙氨酸，消除了保守糖基化位点，从而阻止Fcγ受体结合和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。Cetuximab则因重链可变区存在额外的N-糖基化位点而呈现更高的完整质量和更复杂的质谱图，显著的重叠峰使可靠的峰鉴定变得困难。去卷积参数的选择对结果至关重要，不适当的参数可能产生伪影。质量精度评估显示，约一半的测量峰顶点与理论平均分子质量的偏差小于3 ppm，其余偏差约为20 ppm，最可能归因于共存蛋白形式导致的未解析峰重叠。信号强度RSD为6–14%（N=7），略高于常规ESI-MS分析，这归因于最大记录信号强度取决于基质浓度达到显著干扰蛋白电离水平的时刻，此时蛋白和基质的浓度梯度均接近最高值，微小扰动即可导致信号强度的显著变化。
四、总结与结论
完整mAb质谱分析虽无法完全确定地鉴定每一种糖型，但能提供全局糖基化变化的快速、灵敏且可重复的测量，这对生产和临床性能至关重要。鉴于数百种理论糖型可能共存且即使最先进的质谱仪器也无法完全分辨，初始目标不应是穷尽分离，而是确定稳健且可重复的糖基化指纹图谱。该指纹可反映糖链分布的变化，如岩藻糖基化的有无以及半乳糖基化和唾液酸化的变化。参考品与生物类似药之间或不同生产批次之间的比较分析可明确揭示mAb的改变。TADA-MS甚至无需脱盐或其他简单样品制备步骤，药物制剂可直接注入质谱仪。通过适当调节流动条件，可实现（1）最小样品消耗（53 nL）、（2）快速分析时间（<3分钟）或（3）合理的检测灵敏度。三种流动模式获得的糖基化模式高度一致。由于蛋白质扩散系数随分子尺寸增大而减小，较大的分析物蛋白在Taylor分散过程中经历更大程度的部分分离，从而获得更高的质谱信号强度。因此，TADA-MS特别适用于分析超过常规单克隆抗体尺寸的蛋白质，如工程化蛋白。通过分析10种药物产品，研究人员证明TADA-MS非常适合快速评估整体mAb糖型分布及对应不同聚糖的质量偏移。除在科学研究和临床环境中可能应用于mAb糖基化分析外，TADA-MS在生物制药生产领域尤其具有优势——在该领域，快速、高通量且经济高效的变更检测比详尽的结构细节更为关键。在此背景下，TADA-MS可作为有效的把关方法并应用于过程控制工具。
