整合RNA干扰与转录组测序揭示中华真蛸TRAF基因家族先天免疫调控网络及关键信号通路

《Aquaculture and Fisheries》：Integrated RNAi and RNA-seq approaches reveal immune function of TRAF genes in Octopus sinensis

　　

当中华真蛸（Octopus sinensis）暴露于外部病原刺激时，其主要依赖先天免疫系统（innate immune system）抵抗病原体入侵。在该免疫系统中，肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor receptor-associated factor, TRAF）家族在信号转导中占据核心地位，构成一类关键的信号分子。为阐明OsTRAFs的免疫调控机制，本研究对五个OsTRAF基因（OsTRAF2、OsTRAF3、OsTRAF4、OsTRAF6和OsTRAF7）进行了鉴定。其开放阅读框（open reading frames, ORFs）分别为1473、1629、1431、1797和2121 bp，编码490、542、476、598和706个氨基酸，所有蛋白均含有Really Interesting New Gene（RING）结构域。研究人员通过RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术对O. sinensis中的五个TRAF基因进行沉默。利用定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）对肝胰腺、鳃和体腔（white body）组织的检测显示，所有受检组织中目标转录本均实现高效敲低，其中肝胰腺表现出最高的RNAi效率，因此被选用于后续转录组测序。转录组结果显示，敲低不同的OsTRAF基因导致差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）在多条免疫通路中显著富集，包括磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B, PI3K-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、Hippo、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G, cGMP-PKG）以及KEGG注释的中性粒细胞胞外陷阱形成（neutrophil extracellular trap formation, NETosis）通路。在所有实验组中，OsTRAF4敲低组在PI3K-Akt和MAPK通路中富集的DEGs数量最多，而OsTRAF6敲低组仅在NETosis通路中表现出强烈富集。基于五个敲低组共同下调的136个DEGs构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，拓扑分析鉴定出连接多条免疫通路的九个枢纽基因（hub genes），分别为CASP3、HSP90AB1、JUN、NFKBIA、RELA、CD40、PIK3CA、BIRC2和BIRC3。综上所述，本研究阐明了OsTRAFs通过调控多条信号通路介导O. sinensis先天免疫应答，为头足类免疫学提供了新的见解，并为蛸类养殖中的疾病防控提供了理论基础。

中华真蛸（Octopus sinensis）是我国重要的商业海洋头足类物种，但在养殖条件下易受病原微生物感染，主要依赖先天免疫系统（innate immune system）进行防御。近年尽管对其模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）和效应分子如抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）的认识不断加深，但连接PRR识别与下游免疫激活的胞内衔接蛋白，特别是TRAF（肿瘤坏死因子受体相关因子，tumor necrosis factor receptor-associated factor）家族，在头足类中的免疫功能仍 largely unexplored。头足类在软体动物中占据独特进化地位，其高度发达的神经系统和特殊生理适应提示其免疫调控机制，尤其TRAF家族介导的信号通路，可能已发生功能分化。既往研究虽在双壳贝如虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）中报道了TRAF家族的免疫识别功能，但头足类TRAF介导的免疫通路研究仍属空白，阻碍了全面理解头足类先天免疫。

为填补上述空白，研究人员以实验室前期鉴定的五个OsTRAF基因（OsTRAF2、OsTRAF3、OsTRAF4、OsTRAF6和OsTRAF7）为研究对象，系统解析了其在中华真蛸先天免疫中的调控功能。研究通过体内RNA干扰（RNA interference, RNAi）沉默靶基因，结合转录组测序（transcriptome sequencing, RNA-seq）与蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络分析，揭示了OsTRAFs通过PI3K-Akt、MAPK、Hippo、cAMP、cGMP-PKG及NETosis等多通路协同调控先天免疫应答的分子机制。该研究不仅丰富了头足类免疫学的理论认知，也为蛸类健康养殖中的疾病防控策略提供了重要的分子靶点与理论依据。

研究人员采用的核心技术方法包括：基于T7启动子的体外转录合成双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）并进行活体RNAi注射；利用定量实时PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）检测肝胰腺、鳃和体腔（white body）中的基因沉默效率，并采用2^?ΔΔC_t法计算相对表达量；选取沉默效率最高的肝胰腺组织进行Illumina NovaSeq 6000高通量转录组测序；通过DESeq2软件进行差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）筛选（|log₂FC| ≥ 1且校正后P < 0.05）与GO/KEGG功能富集分析；基于STRING数据库与Cytoscape软件构建PPI网络并进行拓扑分析以筛选枢纽基因（hub genes）。实验用健康野生中华真蛸样本采集自中国福建省福州市连江县定海湾，平均体重（180 ± 20） g。

序列验证与生物信息学分析
研究人员通过开放阅读框（open reading frame, ORF）验证确认了五个OsTRAF基因的序列特征，其ORF长度分别为1473 bp至2121 bp，对应编码490至706个氨基酸。生物信息学分析表明，所有OsTRAF蛋白均含有Really Interesting New Gene（RING）结构域，其中OsTRAF3、OsTRAF4、OsTRAF6和OsTRAF7还含有zf-TRAF（zinc finger-TRAF）结构域；此外，OsTRAF7的C端含有WD40（tryptophan-aspartic acid 40）重复序列，而其余四个OsTRAF则含有高度保守的MATH（meprin and TRAF-C homology）结构域。

体内RNA干扰实验
qPCR检测显示，注射dsRNA后，五个OsTRAF基因在肝胰腺、鳃和体腔中均实现显著转录沉默。肝胰腺中敲低效率最高，OsTRAF2、OsTRAF3、OsTRAF4、OsTRAF6和OsTRAF7的mRNA水平分别下降约73.85%、51.28%、76.51%、84.32%和89.17%。鉴于肝胰腺表现出最强沉默效率，研究人员选择该组织进行后续转录组测序。

转录组测序质量与功能注释
转录组测序共产生117.76 Gb高质量clean data，Q30碱基百分比均超过95.17%。主成分分析（principal component analysis, PCA）显示，各实验组生物学重复聚类良好，且五个OsTRAF RNAi组与EGFP阴性对照组沿PC1轴明显分离。联合组装共获得67,718条转录本，并通过GO、KEGG、EggNOG、NR、Swiss-Prot和Pfam六个数据库完成功能注释。

差异表达基因统计
与EGFP阴性对照相比，OsTRAF2、OsTRAF3、OsTRAF4、OsTRAF6和OsTRAF7敲低后分别鉴定出2,222、3,520、5,587、2,377和4,907个DEGs。其中，OsTRAF4敲低组产生的DEGs数量最多，包含2,093个上调基因和3,494个下调基因。

GO富集分析
GO功能分类显示，各敲低组的DEGs主要富集于分子功能（molecular function）中的结合（binding）与催化活性（catalytic activity）条目，细胞组分（cellular component）中的细胞解剖实体（cellular anatomical entity）和含蛋白复合物（protein-containing complex）条目，以及生物过程（biological process）中的细胞过程（cellular process）、代谢过程（metabolic process）和生物调节（biological regulation）条目。

KEGG富集分析
KEGG通路分析表明，各敲低组DEGs显著富集于环境信息处理（Environmental Information Processing）和人类疾病（Human Diseases）大类，尤其在信号转导（Signal Transduction）和免疫相关通路中表现突出。具体而言，DEGs显著富集于磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Hippo、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）、环磷酸鸟苷-蛋白激酶G（cyclic guanosine monophosphate-protein kinase G, cGMP-PKG）以及中性粒细胞胞外陷阱形成（neutrophil extracellular trap formation, NETosis）等信号通路。其中，OsTRAF4敲低组在PI3K-Akt（84个DEGs）和MAPK（75个DEGs）通路中富集的DEGs数量均高于其他各组；OsTRAF6敲低组则特异地在NETosis通路（56个DEGs）中表现出最强富集。

qPCR验证
为验证转录组数据可靠性，研究人员对10个参与免疫相关KEGG通路的DEGs进行qPCR验证，结果显示其表达模式与RNA-seq结果一致。

PPI网络与枢纽基因筛选
基于五个敲低组共有的136个下调DEGs构建PPI网络，拓扑分析鉴定出九个核心枢纽基因，分别为CASP3、HSP90AB1、JUN、NFKBIA、RELA、CD40、PIK3CA、BIRC2和BIRC3。这些枢纽基因作为跨通路调控因子，协同激活PI3K-Akt、MAPK、Hippo、cAMP、cGMP-PKG及NETosis相关信号通路，表明其在OsTRAF介导的先天免疫中发挥关键调控作用。

讨论与结论
讨论部分指出，五个OsTRAF蛋白的RING结构域为其发挥E3泛素连接酶（E3 ubiquitin ligase）活性及下游免疫信号调控提供了结构基础。zf-TRAF结构域介导蛋白间特异性结合，而C端MATH与WD40结构域的差异可能决定了各OsTRAF成员不同的上游/下游互作蛋白及调控级联反应。研究证实OsTRAFs并非通过单一通路，而是通过靶向上述九个核心枢纽基因，同步调控六条信号通路/过程，从而协调中华真蛸的先天免疫应答。其中，OsTRAF4是PI3K-Akt和MAPK通路的强正调控因子，可能充当信号整合枢纽；OsTRAF3和OsTRAF7也广泛参与PI3K-Akt通路调控；OsTRAF6则与NETosis通路关系最为密切。

研究结论部分强调，通过结合RNAi与转录组测序技术，研究人员成功在中华真蛸中沉默五个OsTRAF基因。OsTRAFs通过调控复杂信号网络参与先天免疫，主要影响PI3K-Akt、MAPK和Hippo信号通路。九个核心免疫枢纽基因介导了多条免疫通路间的串扰（crosstalk）。研究还揭示了不同OsTRAF家族成员的功能分化：OsTRAF4具有最广泛的调控效应，在PI3K-Akt和MAPK通路中发挥关键正调控作用；OsTRAF3和OsTRAF7也强烈参与PI3K-Akt通路调控；OsTRAF6则与NETosis通路表现出特异性关联。这些发现不仅系统阐明了OsTRAFs在中华真蛸免疫应答中的核心作用，也为头足类独特免疫信号网络的深入探索提供了重要的实证依据与理论见解。