《Aquaculture Reports》：Single nucleotide mutations in promoter and exon region of SOD gene alter heat-tolerance of scallops (
Patinopecten yessoensis)
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超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）是评价多细胞生物应激抗性的经典指标之一。本研究旨在阐明虾夷扇贝SOD基因表达与耐热性之间的关系，并筛选耐热虾夷扇贝选择性育种中的潜在生物标志物。研究人员选取虾夷扇贝“明玉”（Mingyue）品
超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）是评价多细胞生物应激抗性的经典指标之一。本研究旨在阐明虾夷扇贝SOD基因表达与耐热性之间的关系，并筛选耐热虾夷扇贝选择性育种中的潜在生物标志物。研究人员选取虾夷扇贝“明玉”（Mingyue）品系和常规养殖品系作为研究材料，通过渐进式热应激处理从“明玉”虾夷扇贝中筛选出热敏感个体（Heat-susceptible individuals, HS）和热耐受个体（Heat-tolerant individuals, HT），并首次初步建立了SOD基因相对表达量与耐热性的相关性。随后，研究在“明玉”虾夷扇贝SOD基因的启动子区和外显子区鉴定出与耐热性相关的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism, SNP）位点，并在常规养殖虾夷扇贝群体中进行了验证实验。研究进一步初步解析了SOD基因中已鉴定SNP影响虾夷扇贝耐热性的分子机制。结果表明：1）SOD基因相对表达量与虾夷扇贝的耐热性密切相关；2）在SOD基因启动子区鉴定出两个SNP位点（g.–538 A > C和g.–304 T > A），在外显子区鉴定出三个SNP位点（c.229 C > T、c.284 C > A和c.348 C > A）。所有已鉴定SNP位点均表现为中度多态性（0.25 ≤ 多态信息含量（Polymorphism Information Content, PIC） < 0.5），且其分布符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium, P > 0.05）。与HS组相比，HT组的优势基因型分别为CA（g.–538 A > C）、AT（g.–304 T > A）、CT（c.229 C > T）、CA（c.284 C > A）和CA（c.348 C > A）。生物信息学分析表明，上述已鉴定SNP的突变可能影响SOD启动子与转录因子（transcriptional factors）的结合亲和力、SOD信使RNA（messenger ribonucleic acid, mRNA）的稳定性以及SOD蛋白的空间结构。
虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）是原产日本北部的典型温带贝类，适宜生长水温为5°C至20°C，最适生长温度为15°C。该物种于20世纪80年代引入中国后，已形成规模化养殖产业，近五年平均年产量达183.4万吨。然而，作为海洋生物变温动物，虾夷扇贝的原始耐热性相对较弱，易受海洋热浪影响。近年来，中国北方沿海主养区夏季海水温度频繁超过23°C，持续的热胁迫导致养殖虾夷扇贝大规模死亡事件日益频发。因此，开展耐热虾夷扇贝品系选育已成为该产业的核心关切。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）作为细胞抗氧化防御体系的核心组成成分，通过催化超氧阴离子自由基（O
2-）歧化为过氧化氢和分子氧气，维持细胞氧化还原稳态，保护蛋白质、脂质及DNA免受氧化损伤。既往研究多集中于SOD活性与生物体应激抗性的关联，但关于其核苷酸序列组成变异如何影响抗逆能力的研究仍相对匮乏。近年来海洋热浪发生频率与强度显著增加，导致的夏季生物大规模死亡事件使系统解析水生生物热胁迫性状形成机制并培育耐热品种成为水产养殖业的核心关切。
针对上述问题，研究人员以经长期选育的“明玉”（Mingyue）虾夷扇贝品系和常规养殖品系为研究对象，系统开展了SOD基因表达与耐热性关联分析、SNP位点筛选及验证实验。研究通过渐进式热应激处理筛选表型，结合qRT-PCR、RNAi、常规PCR扩增与测序、生物信息学分析及群体遗传学分析等技术手段，首次初步建立了虾夷扇贝SOD基因相对表达量与耐热性的相关性，并在SOD基因启动子区和外显子区鉴定出5个与耐热性相关的SNP位点，明确了其基因型分布特征与群体遗传参数。该研究成果不仅深化了对SOD基因在虾夷扇贝耐热性状形成中功能机制的认识，更为耐热虾夷扇贝的选择性育种提供了新型分子标记和理论依据。
研究人员采用的主要关键技术与方法包括：利用实时荧光定量PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）技术检测热敏感个体（Heat-susceptible individuals, HS）与热耐受个体（Heat-tolerant individuals, HT）鳃组织中SOD基因的相对表达量，并通过RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术注射SOD-siRNA或NC-siRNA进行基因功能丧失实验，结合热胁迫存活率统计验证SOD的表达功能；基于常规PCR扩增及测序技术对SOD基因启动子区（2028 bp）和外显子区（593 bp）进行序列测定，利用SnapGene与SeqMan软件进行序列比对与突变位点识别，结合人工校对进行突变峰图分析，采用Popgene 32及GenAlEx等软件进行群体遗传参数分析；运用JASPAR软件进行转录因子结合位点预测，利用RNAfold WebServer分析信使RNA（messenger ribonucleic acid, mRNA）二级结构，借助Expasy Protparam、SMART、SOPMA及SWISS-MODEL等工具解析蛋白理化性质与空间结构。研究样本来源于大连獐子岛集团提供的“明玉”品系及常规养殖群体（大连群体）。
SOD相对表达与耐热性的关系
qRT-PCR分析显示，经72小时热应激后，HT个体鳃组织中SOD基因的相对表达量显著高于HS个体（P < 0.01）。为验证该关联，研究人员通过RNAi技术敲低SOD基因表达，结果显示注射小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）SOD-siRNA的虾夷扇贝在热应激72小时后的存活率仅为33.3%，显著低于注射阴性对照（NC-siRNA）组的86.7%（P < 0.05），表明SOD表达水平的降低会显著增加高温条件下的死亡风险，从而证实SOD基因表达与虾夷扇贝耐热性密切相关。
SOD基因启动子与外显子区SNP位点鉴定
通过常规PCR扩增与测序，研究人员在“明玉”品系虾夷扇贝中共鉴定出5个SNP位点，其中启动子区2个（g.–538 A > C和g.–304 T > A），外显子区3个（c.229 C > T、c.284 C > A和c.348 C > A）。外显子区各位点均观察到两种基因型，而启动子区各位点均观察到三种基因型。群体遗传分析表明，所有位点均表现为中度多态性（0.25 ≤ PIC < 0.5），符合哈迪-温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium, HWE, P > 0.05）。HS与HT组在c.229 C > T、c.348 C > A及两个启动子位点上的基因型与等位基因频率差异显著（P < 0.05），且g.–304 T > A位点的AA基因型仅在HT个体中检测到，提示该位点与耐热性高度相关。
候选SNP位点在常规养殖群体中的验证
在大连常规养殖群体（n = 30）中，研究人员对上述SNP位点进行了耐热性关联验证。结果显示，携带外显子区突变基因型（CT at c.229 C > T、CA at c.284 C > A和CA at c.348 C > A）的个体，其SOD基因表达量及72小时热应激存活率（86.67%、93.33%、93.33%）均显著高于对应敏感基因型（CC）个体（33.33%）。启动子区方面，携带CA（g.–538 A > C）和AT（g.–304 T > A）基因型的个体表现出更高的SOD表达水平和存活率，表明这些SNP位点在常规养殖群体中同样与耐热性相关联。
外显子区SNP对mRNA与蛋白结构及功能的影响
生物信息学分析表明，外显子区SNP突变显著影响SOD mRNA的二级结构与最小自由能（Minimum free energy, MFE）。HS个体（CC基因型）的MFE为-148.40 kcal/mol，高于HT个体（突变基因型）的-153.60 kcal/mol，且HT个体的mRNA具有更多的发夹环和内环结构，提示突变可能增强mRNA稳定性。在蛋白水平上，c.284 C > A和c.348 C > A突变分别导致组氨酸（His）和苏氨酸（Thr）转变为天冬酰胺（Asn），使蛋白等电点（isoelectric point, pI）从4.51降至4.46，净电荷由-12变为-13。二级结构预测显示，HT个体SOD蛋白的α-螺旋比例由48.00%降至42.28%，无规卷曲比例由37.14%升至42.86%，且蛋白不稳定性指数由35.71降至35.28，表明突变可能通过改变蛋白空间构象和增强结构稳定性来影响其功能。
启动子区SNP对转录因子结合能力的影响
JASPAR预测分析显示，SOD启动子区含有多个相对评分≥0.85的转录因子（transcriptional factors）结合位点。其中，Bsx和Emx在1345(+)位点的结合亲和力在HS组与HT组间存在差异：Bsx在HS组的相对评分为0.92，高于HT组的0.90；Emx在HS组的评分（0.93）亦略高于HT组（0.92），提示启动子区SNP可能通过改变转录因子结合能力来调控SOD基因的转录效率。
研究人员在讨论中首先验证了以壳张开口度、运动及摄食行为区分虾夷扇贝不同耐热表型的有效性，并指出“明玉”品系中HT个体比例（75%）显著高于HS个体（25%），证实该品系具有耐热优越性。通过功能丧失实验与表达谱分析，研究确认SOD在双壳类氧化应激应答中发挥关键作用，其相对表达量可作为耐热性候选生物标志物。进一步机制解析表明，启动子区SNP可能通过削弱或改变转录因子与启动子的结合亲和力来调控基因表达；外显子区SNP则可能通过增强mRNA稳定性、改变蛋白氨基酸组成与空间构象来提升SOD蛋白功能效率，进而赋予个体更强的耐热能力。基于上述发现，研究人员提出在耐热虾夷扇贝育种中，可先对候选群体进行鳃组织非损伤性取样，通过测序筛选SOD启动子区CA（g.–538 A > C）、AT（g.–304 T > A）及外显子区特定突变基因型的个体进行定向选育。同时，研究也指出外显子区各SNP位点仅检测到两种基因型，后续需扩大样本量和遗传多样性群体以阐明成因；未来还需深入验证SNP驱动的转录效率变化、mRNA与蛋白结构动态及表观遗传调控（如非编码RNA）对SOD表达的影响，以全面揭示虾夷扇贝耐热性状的分子基础。
