利用高效脱氢酶将CO?生物催化转化为甲醛和甲醇

《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Biocatalytic Conversion of CO 2 to Formaldehyde and Methanol Using Efficient Dehydrogenases

　　

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  XaFDH在CO₂还原方面的催化效率比CbFDH高15倍。
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  结构分析显示其底物通道扩大，底物结合能力增强。
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  鉴定出高效的PlFaldDH，促进了甲醛的高产。
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  建立的多酶级联反应可高效地将CO₂转化为甲醛和甲醇。

引言

二氧化碳（CO₂）是最主要的人为温室气体，它持续在大气中积聚并推动气候变化[1]。因此，开发有效的CO₂减排策略已成为全球优先事项[2]。在现有的方法中，通过生化途径——尤其是酶介导的过程——将CO₂转化为高附加值化学品的方法受到了越来越多的关注，因为这些方法具有温和的操作条件、高选择性和环境兼容性[3]。尽管有这些优势，但酶促CO₂转化受到现有生物催化剂催化效率低的限制，这需要较高的酶负载量并限制了产物的产量[4]。因此，鉴定出高效的CO₂固定酶对于建立经济可行的生物基CO₂转化技术至关重要。

甲酸脱氢酶（FDH；EC 1.2.1.2）能一步将CO₂还原为甲酸，在酶促CO₂转化中起着关键作用[5], [6]。FDH大致分为依赖金属和不依赖金属的两种类型。依赖金属的FDH含有钼或钨双钼蝶呤鸟苷二核苷酸（Mo/W-bis-MGD）辅因子，并具有较高的CO₂还原催化效率[7], [8], [9]。然而，由于对氧气的敏感性、在有氧条件下的活性降低以及结构复杂性，这些酶的实际应用受到限制，这给酶的处理和过程实施带来了困难[8], [10], [11]。相比之下，不依赖金属的FDH由于缺乏金属辅助的氢转移，其CO₂还原活性通常较低。不过，它们具有多种实用优势，包括耐氧性、高溶解性、易于异源表达以及易于操作[5], [12], [13]。不依赖金属的FDH也被称为NAD⁺依赖型FDH（EC 1.17.1.9），属于d-异构体特异性2-羟基酸脱氢酶超家族[7], [14]。从结构上看，这些酶通常由一个催化域和一个NAD⁺结合域组成，两者通过一个深裂隙分隔开。辅因子结合域位于初级序列的中心区域，而催化域则由剩余的N端和C端区域构成[5], [11], [15], [16]。FDH通过甲酸的C_α原子与NAD⁺/NADH的C₄N原子之间的直接氢转移，实现甲酸和CO₂的可逆转化。这种反应由精确的活性位点相互作用介导，使得NAD⁺依赖型FDH能够在不添加金属离子或其他辅因子的情况下进行有氧反应[7], [11], [18]。

虽然所有NAD⁺依赖型FDH都能催化甲酸的氧化，但并非所有酶都表现出显著的CO₂还原活性[13], [19]。Candida boidinii的FDH（CbFDH）是一种已知的模型酶，能够将CO₂还原为甲酸，并已被广泛用于酶促CO₂转化系统以生产甲酸和甲醇[13], [20]。然而，其较低的CO₂还原活性是实际应用的主要限制，这突显了寻找更高效FDH以利用CO₂的必要性[13], [20], [21], [22]。最近的研究发现了几种具有可测量CO₂还原活性的FDH，表明不同来源的酶之间的催化效率存在显著差异。例如，来自Thiobacillus sp. KNK65MA（TsFDH）和Paracoccus sp. MKU1（PaFDH）的FDH的活性分别为12.2 ± 0.13和6.5 ± 0.06 mU·mg^-1[22], [23]。在最佳条件下，Chaetomium thermophilum（CtFDH；34.6 ± 0.07 mU·mg^-1）的活性更高[24]，最近的量子力学/分子力学计算也证实了CtFDH在CO₂还原方面的活化能低于Pseudomonas sp. 101（PsFDH）[25]。然而，尽管CtFDH的活性较高，但其稳定性相对于其他FDH（如CbFDH）较低，这限制了其实际应用[24]。通过酶工程也增强了FDH的CO₂还原活性。例如，CbFDH的双突变体V328I/F285W和V354G/F285W的活性分别比野生型酶高出约8.6倍和6.7倍[26], [27]。同样，CtFDH的双突变体（G93H/I94Y）的催化效率提高了5.4倍（k_cat/K_m）[28]，而PaFDH的F248M/A169I/D245G变体的活性提高了7倍以上[22]。尽管取得了这些进展，但要实现实际应用往往还需要大量的工程改造，这突显了鉴定天然高效FDH作为生物催化剂开发起点的重要性。

已经开发了由FDH、甲醛脱氢酶（FaldDH）和醇脱氢酶（ADH）组成的多酶级联反应，用于连续将CO₂转化为甲酸、甲醛和甲醇[19], [22], [29]。然而，由于FDH和FaldDH的催化活性有限，这些系统的甲醇产率通常较低（<1 mM）[19], [30]。因此，鉴定出高活性的FDH对于克服这一瓶颈至关重要。为了解决辅因子限制，已将使用亚磷酸脱氢酶（PTDH）、甘油脱氢酶[19], [31]或葡萄糖脱氢酶[32]的NADH再生系统整合到这些级联反应中，从而实现了辅因子的连续循环利用，提高了甲醇产量并降低了运营成本[19], [29]。

在这项研究中，我们报道了一种来自Xanthobacter sp. 91（XaFDH）的高效CO₂还原FDH，其CO₂还原催化效率比CbFDH高15倍，并且在酸性条件下仍保持80%以上的活性。NADH结合的K_d值也表明XaFDH对NADH的结合更紧密。由于甲酸转化为甲醛也是CO₂生物转化中的一个限制步骤，因此还对比筛选并选择了FaldDH和ADH，以建立高效的多酶级联反应。实验结果表明，该级联反应能够高效地生产甲醛（化学合成的重要中间体），达到306.02 ± 6.30 μM的浓度，以及高达3.03 mM的甲醇产量。这些发现表明脱氢酶是用于酶促CO₂转化的稳健且高效的生物催化剂。

章节片段

材料

所有使用的化学品均为分析级或生物分子级，购自Sigma-Aldrich（美国马萨诸塞州伯灵顿）和东京化学工业有限公司（日本东京中央区）。分子生物学试剂和Phusion DNA聚合酶购自Biotechrabbit GmbH（德国柏林）。寡核苷酸引物由Macrogen Inc.（韩国首尔）合成。凝胶/聚合酶链反应（PCR）纯化试剂盒和DNA提取试剂盒购自Favorgen Biotech Corp.

XaFDH的生物化学和动力学特性

通过Enzyme Function Initiative（EFI）平台进行的序列相似性网络分析，我们鉴定出了XaFDH[43]。序列分析（图S2）显示XaFDH与之前报道的具有较高CO₂还原活性的FDH具有高序列一致性，包括TsFDH（90%一致性）和PaFDH（80%一致性）[13], [22], [24]。因此，我们假设XaFDH也可能具有增强的CO₂还原能力。因此，我们对其进行了评估

结论

在这项研究中，通过鉴定和整合高活性的脱氢酶，成功开发了一种高效的酶促级联反应，用于将CO₂转化为高附加值化合物。来自Xanthobacter sp. 91的新型XaFDH显示出比传统CbFDH显著改进的CO₂还原活性和底物结合亲和力。进一步的结构和分子分析表明，XaFDH的增强催化活性归因于其更大的底物通道

CRediT作者贡献声明

Panu Pimviriyakul：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、形式分析。Pratchaya Watthaisong:撰写 – 审稿与编辑、监督、研究、形式分析、数据管理。Suradit Jaroenwetwut:方法学、研究。Prawit Thitayanuwat:撰写 – 初稿撰写、可视化、软件开发、研究、形式分析。Thunchanok Wilasri:撰写 – 初稿撰写、方法学、研究、形式分析。Ruchanok Tinikul:撰写 – 审稿与编辑、撰写

未引用的参考文献

[33], [65]。

利益冲突

作者声明与本文内容没有利益冲突。

数据可用性声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

玛希隆大学（基础基金：2026财政年度）和创新基金（NSRF）（FF-107/2569）的支持。该项目还得到了泰国国家研究委员会（NRCT）和玛希隆大学对RT（N42A680374）的资助。作者还感谢泰国科学研究成就奖学金（SAST）（给TW）、中央仪器设施（CIF）、玛希隆大学理学院（给RT）、Burapha大学（给SM）的支持

Thunchanok Wilasri|Prawit Thitayanuwat|Suradit Jaroenwetwut|Pratchaya Watthaisong|Panu Pimviriyakul|Somchart Maenpuen|Jeerus Sucharitakul|Utid Suriya|Ruchanok Tinikul