引言
透明质酸是一种高分子量的线性糖胺聚糖，由重复的D-葡糖醛酸和N-乙酰-D-葡萄糖胺二糖单元组成。它是脊椎动物细胞外基质（ECM）的基本组成部分[1]。透明质酸具有多种关键生理功能：维持体内液体平衡和渗透压平衡，支持器官的正常形态，在物质交换过程中形成保护屏障，为关节运动提供润滑，并吸收外部机械冲击[2]。此外，透明质酸具有优异的生物相容性和生物降解性，因此在生物医学和化妆品领域备受关注[3]。通过与特定细胞表面受体（如CD44和RHAMM）相互作用，透明质酸在维持组织水合、结构完整性、粘弹性和细胞信号传导中起着关键作用[3],[4],[5]。透明质酸的合成（由透明质酸合成酶HAS催化）与降解（由透明质酸酶HAase催化）之间的动态平衡对胚胎发育、伤口愈合和组织重塑等正常生理过程至关重要。然而，透明质酸代谢的失调，特别是透明质酸酶的过度表达或活性增强，越来越多地被认为与各种病理状况相关[6]。透明质酸酶构成了一类酶，能催化透明质酸中的β-1,4-糖苷键的水解，生成低分子量片段。虽然这种活性对正常组织更新至关重要，但过度的透明质酸酶活性会导致ECM完整性和屏障功能的破坏。这种破坏促进了疾病进展的核心过程：在炎症和过敏反应中，它会增加血管通透性和免疫细胞浸润；在癌症中，它通过降解细胞周围的组织透明质酸基质来促进肿瘤细胞侵袭、转移和血管生成；在皮肤学中，加速的透明质酸降解会导致皮肤老化，表现为干燥、弹性丧失和皱纹形成[7],[8]。此外，细菌产生的透明质酸酶可作为毒力因子，帮助病原体传播。因此，透明质酸酶已成为针对多种疾病（包括骨关节炎、慢性炎症、癌症转移甚至皮肤老化）进行药物开发的引人注目的治疗靶点[9],[10],[11]。
寻找有效的透明质酸酶抑制剂涉及多种化学结构类型。早期研究发现了非特异性药物和内源性血清抑制剂。合成化合物和已知药物（如非甾体抗炎药）虽然具有抑制作用，但往往缺乏特异性，并可能带来不良副作用。天然产物提供了结构多样且潜在更安全的抑制剂来源。其中，黄酮类化合物——一种普遍存在的植物次级代谢物，具有独特的C6-C3-C6骨架——受到了广泛关注[12]。黄酮类化合物广泛存在于水果[13]、蔬菜[14]、茶叶和草药[15],[16]中，是人类饮食的重要组成部分，并与多种健康益处相关联，包括抗氧化、抗炎和心脏保护作用[17]。近年来，人们越来越关注黄酮类化合物对透明质酸酶的抑制作用，因为这符合对针对慢性炎症和皮肤老化功能的食品的需求增长。尽管有实验证据表明黄酮类化合物的结构与其对透明质酸酶的抑制作用有关，但对其相互作用机制的全面原子级理解仍然不完整。其生物活性高度依赖结构：影响效力的关键结构特征包括C环2位和3位之间的双键、羟基化模式（特别是在5位、7位和4'位），以及避免糖基化（因为它可能引入空间阻碍[18],[19]。尽管有这些实验证据，但对特定黄酮类化合物如何与透明质酸酶相互作用及其抑制机制的全面原子级理解仍不完整。精确的结合模式、不同相互作用中的能量贡献以及抑制剂结合对酶构象的动态影响尚未完全阐明。
计算结构生物学提供了强大的工具来填补这一知识空白。分子对接可以预测配体在蛋白质活性位点内的最佳结合姿态，并识别关键相互作用残基[20]。分子动力学（MD）模拟通过模拟蛋白质-配体复合物在水环境中的时间依赖行为，提供了关于复合物稳定性、构象灵活性和分子间相互作用动态的见解[21]。使用分子力学/泊松-玻尔兹曼表面积（MM-PBSA）等方法对MD轨迹进行后处理，可以计算结合自由能并分解能量贡献，从而提供抑制效应的定量热力学分析[22],[23]。
在本研究中，我们采用了一种综合的计算和实验策略。首先，我们利用分子对接系统地筛选了包含多种黄酮类化合物的库，以评估它们与BTH活性位点的潜在结合能力。我们没有仅根据对接得分来选择化合物，而是采用了受控制的羟基取代策略。选择芹菜素（4′,5,7-三羟基黄酮）作为母体骨架。山柰酚（3,4′,5,7-四羟基黄酮）和木犀草素（3′,4′,5,7-四羟基黄酮）分别是在芹菜素C3位和C3′位添加一个羟基形成的。由于山柰酚和木犀草素的总羟基数相同，但额外羟基的位置不同，这使我们能够区分增加羟基数量（芹菜素与四羟基黄酮）与羟基位置（C3与C3′）的影响。分子对接用于检查这三种骨架是否能够适应BTH活性位点；但它不是主要的选择标准或定量亲和力测量方法。这些化合物的结构如图1所示。随后，我们通过体外酶抑制实验验证了这三种化合物对BTH的实际抑制作用，确定了它们的半数最大抑制浓度（IC50），并通过米氏动力学曲线（Michaelis-Menten plot）分析确定了它们的抑制类型为竞争性抑制。
基于这一实验验证，我们对这些选定的化合物与BTH形成的复合物进行了100纳秒的全原子MD模拟。这旨在提供关于复合物内构象稳定性、动态特性和关键相互作用持久性的深入原子级评估。使用独立重复实验来区分可重复行为和特定于轨迹的波动。所有比较分析都使用了重复实验的平均值±标准差，适当时进行了统计比较。最后，应用MM-PBSA方法对模拟轨迹进行了分析，以量化结合自由能并解析各种相互作用的能量贡献。
我们的工作遵循了“计算预测→实验验证→基于模拟的阐明”的完整研究路径，旨在为黄酮类化合物的结构-活性关系建立详细的分子理论基础，并系统地揭示参与透明质酸酶抑制的关键残基和作用力。这些发现不仅加深了对黄酮类化合物生物活性的机制理解，还为基于天然产物骨架的新型、高效和选择性透明质酸酶抑制剂的设计和优化提供了坚实的理论和实验框架。
