《Archives of Biochemistry and Biophysics》：Characterization of cancer stem-like cells derived from a single 4T1 murine triple-negative breast cancer cell: Involvement of Akt?mTOR pathway in the proliferation and sphere formation.
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•从小鼠TNBC 4T1的一个细胞中建立了两个类似CSC的细胞克隆。•这两个克隆表达了CSC标志物，并显示出较高的体内致瘤性。•Akt–mTOR通路可能参与了类似CSC的细胞的球形形成。•Akt–mTOR通路可能是消除TNBC干细胞的治疗靶点。引言癌症干细胞（CSCs）是一类具有
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从小鼠TNBC 4T1的一个细胞中建立了两个类似CSC的细胞克隆。
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这两个克隆表达了CSC标志物，并显示出较高的体内致瘤性。
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Akt–mTOR通路可能参与了类似CSC的细胞的球形形成。
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Akt–mTOR通路可能是消除TNBC干细胞的治疗靶点。
引言
癌症干细胞（CSCs）是一类具有自我更新能力和分化潜力的肿瘤细胞亚群，能够形成肿瘤[1][2]。此外，由于CSCs被认为会促进肿瘤复发和转移[2]，并且对传统化疗和放疗具有抗性[3][4]，治疗后存活的CSCs可能会导致复发和转移[2][5]。因此，开发针对CSCs的疗法被视为癌症治疗的新策略。
三阴性乳腺癌（TNBC）是最具侵袭性的乳腺癌亚型，占所有报告病例的15-20%[6]。由于TNBC缺乏所有三个可靶向的受体——即人表皮生长因子受体-2（HER2）、雌激素受体和孕激素受体——目前没有有效的激素和HER2靶向疗法[7][8]。此外，TNBC中含有乳腺CSCs[9][10][11][12]，这些细胞可能是其耐药性的原因[13]。因此，CSCs是治疗TNBC的有吸引力的目标[14][15]；然而，针对CSCs的疗法尚未获得临床应用批准[16]。
在本研究中，我们使用4T1作为TNBC细胞系来建立和表征源自4T1的类似CSC的细胞。为了分离CSCs，我们利用了单细胞形成的球体培养方法[17][18][19][20]。这样做的原因如下：虽然干细胞能够在无附着条件的环境下存活和增殖[21]，但正常分化的细胞在形成聚集体后也能在球体培养方法中存活和增殖[22]。利用针对CSC标志物的特异性抗体进行荧光激活细胞分选（FACS）可能会因为CSCs的表型异质性而无法获得具有致瘤性的CSCs[2][11][23][24]。
阐明CSCs功能的机制对于开发新型的CSC靶向疗法至关重要。迄今为止，已有许多信号通路被发现可以调节CSC的功能，如致瘤性、转移和药物抗性[25][26][27]。在乳腺CSCs中，磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）–Akt–雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路参与了增殖、存活、自我更新、致瘤性和耐药性[28][29]。Wnt通路与乳腺CSCs的增殖、存活、自我更新、球体形成和侵袭有关[30][31]。核因子-κB（NF-κB）的激活也参与了乳腺CSCs的增殖、存活、干性维持、扩张和致瘤性[30][32][33][34][35]。
在本研究中，我们从小鼠TNBC 4T1细胞中分离出了多个单细胞克隆，研究了它们的类似CSC的特性，并发现两个克隆（6A10和6A12）在体内的致瘤性显著高于亲本4T1细胞，并表达了CSC标志物。随后，我们将这两个TNBC来源的克隆视为治疗TNBC 4T1的目标，并研究了各种信号通路抑制剂对它们增殖和球体形成的影响。
章节片段
材料
多柔比星盐酸盐（DOX）、肝素和聚乙烯亚胺从Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买。紫杉醇（PTX）由Sawai Pharmaceutical Co., Ltd.（日本大阪）提供。顺铂（CDDP）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、RPMI-1640培养基、DMEM/F12培养基和层粘连蛋白溶液从FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）获得。LY294002、GSK2110183和XAV-939从Selleck Biotechnology（日本神奈川）购买。雷帕霉素和QNZ从
从小鼠TNBC 4T1细胞中开发单细胞克隆
将小鼠TNBC 4T1细胞以每孔0.5个细胞的密度接种在96孔板中，在显微镜观察下确认384孔中有31孔含有单个细胞。这些单细胞在CSC培养基中进一步培养，形成了16个肿瘤球体。在细胞增殖过程中，10个克隆形成了悬浮的球体，而另外6个克隆则在悬浮培养板中仍然以贴壁细胞的形式存在。
CSC标志物的mRNA和蛋白质表达
选择ALDH 1A1（ALDH1A1）和CD44v作为CSC标志物进行检测，因为它们
讨论
在本研究中，我们成功地从一个TNBC 4T1细胞中开发出了两个类似CSC的细胞（6A10和6A12），并表征了它们的类似CSC的特性。
CSC标志物的表达分析表明，6A10和6A12细胞高度表达了CD44v，但ALDH活性较低（图1和图2）。这些结果表明我们开发的克隆在CSC标志物的表达上存在不一致性；然而，这一发现与先前的研究结果一致，即只有1.5%的CD44v阳性细胞
结论
CRediT作者贡献声明
Kazutaka Higaki：写作 – 审阅和编辑，实验研究。Wataru Hiraoka：实验研究，数据分析。Miho Seguchi：实验研究，数据分析。Taketo Yoshitomi：实验研究，数据分析。Masato Maruyama：写作 – 初稿撰写，数据可视化，实验设计，研究指导，资金获取，概念构思
伦理声明
本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。该研究已获得冈山大学动物护理和使用委员会的批准。
数据获取
支持本研究结果的数据包含在本文及其补充信息中。肿瘤生长的原始数据和Western blot图像的数据分别包含在补充表4和补充图2中。其他实验数据可根据合理要求提供。
资助
本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）的科学研究资助（JP20K07155、JP23K06211、JP26K09802）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文报道工作的财务利益和个人关系。
致谢
本研究部分得到了冈山大学医院生物库（Okadai Biobank）和冈山大学核心设施（CFPOU OBB-019、DGP-508、DGP-05）的支持。
Masato Maruyama|Taketo Yoshitomi|Miho Seguchi|Wataru Hiraoka|Kazutaka Higaki
