基于多阶段整合计算流程的vigabatrin类似化合物作为潜在VGAT靶向候选物的发现与评估

《Current Issues in Molecular Biology》：Integrated Computational Discovery and Evaluation of Vigabatrin-Similar Compounds as Potential VGAT-Targeting Candidates

　　

囊泡γ-氨基丁酸（GABA）转运体（VGAT；SLC32A1）在抑制性神经传递中发挥关键作用，负责将GABA转运至突触囊泡。鉴于GABA能抑制功能受损与癫痫相关，鉴定潜在VGAT靶向化合物仍是研究GABA能神经传递调控的重要目标。本研究旨在建立一个计算流程，用于整理vigabatrin类似化合物并将其优先级排序，作为潜在的VGAT调节剂供进一步研究。研究人员对一个包含182条记录的SwissSimilarity集合进行了处理，该集合依次经过连续过滤，包括剔除内源性代谢物、放射性示踪剂与参考化合物；独立的二维指纹相似性评估；药物样性评价；结构警示（structural-alert）筛选；以及经数据库验证的药理学分类。筛选所得化合物随后通过分子对接、分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟以及拉伸分子动力学（steered molecular dynamics，SMD）进行评估。初始集合中108种化合物（59.3%）对应内源性代谢物、GABA旁路相关分子、立体异构体或放射性标记衍生物。基于结构的分析提供了关于配体-VGAT相互作用模式、复合物稳定性以及对抗配体置换能力的互补性预测。在所考察的化合物中，DB12444、DB04235和DB17839在施加的拉伸方案下表现出相对较强的力响应，支持其被优先纳入进一步研究。该分析建立了一个多阶段框架，整合化学整理、经独立评估的结构相似性以及基于结构的模拟，以对vigabatrin类似化合物进行优先级排序。所得计算证据可为实验筛选潜在VGAT调节剂提供指导。

一、研究背景

神经传递依赖中枢神经系统中兴奋性与抑制性信号的动态平衡。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是成熟哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，其能抑制功能受损与癫痫、焦虑、精神分裂症及神经发育性疾病相关。囊泡GABA转运体（vesicular GABA transporter，VGAT；亦称囊泡抑制性氨基酸转运体VIAAT，由SLC32A1基因编码）属氨基酸-多胺-有机阳离子（amino acid polyamine organocation，APC）转运体超家族，利用囊泡电化学梯度将GABA与甘氨酸转运入突触囊泡，是抑制性突触传递的核心调控者。然而，VGAT的配体识别机制尚未充分表征，且缺乏实验解析的VGAT结构，限制了基于结构的合理抑制剂设计。氨己烯酸（vigabatrin）可急性抑制VGAT且亲和力与GABA相当，但慢性给药后抑制作用减弱，可能与其致惊厥的早期效应相关，且存在视野缺损风险。因此，鉴定选择性VGAT靶向化合物既可作为成像GABA能神经末梢与探究癫痫、亨廷顿病及脑缺血中神经元丢失的分子探针，也是研究GABA能神经传递调控的重要目标。

二、研究人员开展的研究、结论与意义

研究人员以vigabatrin为查询化合物，针对DrugBank数据库开展SwissSimilarity联合二维/三维相似性筛选，获得182条记录，经多阶段过滤整理保留74种新命中化合物（本研究的软件、方法学、分析与初稿主要由M.Y.完成）；同时利用AlphaFold2预测人VGAT全长结构并进行立体化学与动力学稳定性验证。随后通过CDOCKER分子对接、分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟及拉伸分子动力学（steered molecular dynamics，SMD）模拟对所选VGAT-配体复合物进行互补性分析。研究认为DB12444与DB04235为最具前景的候选化合物，DB17839亦表现出有利的相互作用能与广泛的氢键；所建立的多阶段框架为转运蛋白定向药物发现中的化合物优先级排序提供了可复现的计算策略，可指导候选VGAT调节剂的实验筛选。

三、主要关键技术与方法

研究人员用到的主要技术方法包括：以vigabatrin为查询化合物、针对DrugBank数据库执行的SwissSimilarity二维/三维相似性筛选（样本队列为182条记录的SwissSimilarity集合）；连续过滤流程，即剔除内源性代谢物、立体异构体、放射性标记示踪剂与参考化合物，独立的二维指纹相似性评估，Lipinski五规则（Rule of Five，Ro5）类药性评价，结构警示（structural-alert）筛选，以及基于PubChem与ChEMBL数据库InChIKey查询与GABA关键词匹配的药理学分层；AlphaFold2结构预测与MolProbity、VADAR验证；P2Rank（PrankWeb）结合口袋预测；CDOCKER分子对接；GROMACS 2022下的200 ns及100 ns MD模拟；以及SMD模拟。

四、研究结果

3.1 筛选输出与整理概述：SwissSimilarity导出182条记录，经三项排除标准移除108条（59.3%），保留74条（40.7%）新命中化合物。

3.2 理化性质与药物样性：74种新命中化合物均满足Lipinski五规则（Rule of Five，Ro5）且无任一指标违反；分子量范围103.1–301.3 Da，平均拓扑极性表面积78.8 ?²，呈小体积、极性氨基酸样特征。

3.3 数据库验证的药理学分层：2种（2.7%）为已知GABA系统药物/工具化合物（Arbaclofen与Baclofen，均为GABA_B受体激动剂），3种（4.1%）为已知但无关药理学药物（Aminocaproic acid、Pregabalin、AV-101），69种（93.2%）未检索到作用机制记录。Pregabalin虽为GABA类似物，但因ChEMBL记录的作用靶点为电压门控钙通道α₂δ亚基而被正确归入无关药理学层。

3.4 VGAT结构评估与验证：截断模型（407个残基）经MolProbity评估，95.8%残基位于拉氏图（Ramachandran plot）优势区；200 ns MD模拟显示平均主链均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）0.30 nm、平均残基均方根涨落（root-mean-square fluctuation，RMSF）0.13 nm、回转半径（radius of gyration，Rg）2.13 nm、溶剂可及表面积（solvent accessible surface area，SASA）217.69 nm²，模型整体紧凑稳定。

3.5 配体结合口袋分析：P2Rank虽对多个口袋给出更高排序，但基于膜内可及性顾虑及其位于转运体内向侧的位置，选择pocket 8进行对接，因其可能提供沿底物转位通路的配体结合区域。

3.6 分子对接分析：全部74种化合物完成对接并按CDOCKER能量排序，前10位进入后续分析；候选化合物CDOCKER能量为?36.86至?43.84 kcal/mol，均优于vigabatrin参考（?25.66 kcal/mol），DB12444最低（?43.84 kcal/mol）。

3.7 分子对接相互作用分析：反复出现的识别残基包括Ala128、Asn127、Phe315、Thr318与Tyr221，构成与vigabatrin相同的保守接触区；Ala128与Asn127常与配体氨基形成氢键，Phe315参与氢键或π-阳离子相互作用，提示该口袋可容纳同时含氨基与羧基的配体。

3.8 分子动力学模拟分析：DB21260平均配体RMSD最低（0.18 ?）且重复间一致性好；DB04235相互作用能最有利（?118 kcal/mol），DB17839次之（?112 kcal/mol）；DB04235平均实际氢键数最高（4.6），DB17839（4.1）、DB21260（3.8）、DB03774（3.4）、DB12444（3.2）、DB02821（3.1）依次递减，均高于vigabatrin（2.5）。

3.9 拉伸分子动力学分析：DB12444与DB04235平均拉伸力最高（分别为31.5与32.2），DB17839（29.5）次之，DB03774、DB21260、DB02821居中，vigabatrin最低（9.5）；DB12444、DB04235与DB17839的平均力分别约为vigabatrin的3倍以上，且在主峰后力值快速下降，提示其配体-转运体接触更稳定、解离更具抗性，支持将其优先纳入进一步研究。

五、讨论总结与研究结论翻译

讨论部分指出，本研究整合化学整理、独立指纹相似性评估、类药性评价、结构警示筛选、数据库验证药理学分类与基于结构的模拟，以提高虚拟筛选的可解释性与可追溯性。主要认识包括：以vigabatrin这类内源性小分子为参考的相似性筛选会捕获占59.3%的内源性代谢物、GABA旁路中间体、立体异构体与放射性示踪剂，凸显系统性剔除的必要性；二维指纹相似性、类药性过滤与结构警示筛选仅为优先级排序工具，不能独立确立安全性、有效性或生物活性，数据库验证分类则是确保可追溯性的重要方法学贡献；分子对接、MD与SMD提供互补的生成假设性质证据，支持DB12444与DB04235为特别有前景的候选化合物；独立MD轨迹间差异与SMD的力依赖性提示需要进一步实验验证。未来研究应直接检验候选化合物与VGAT的相互作用、评估其对囊泡GABA转运的影响并通过实验检测药理选择性。

研究结论：本研究建立了一个用于系统整理并优先级排序vigabatrin类似化合物作为潜在VGAT靶向候选物的整合流程，将182条初始记录精简至74种化合物。联合结构与分子相互作用分析确定DB12444与DB04235为特别有前景的候选化合物，DB17839亦表现出有利的相互作用能与广泛的氢键。这些发现为候选化合物的选择与推进提供了基础。所提出的流程还为转运蛋白定向药物发现中的化合物选择提供了一种可复现的策略。未来研究可在此基础上阐明优先化合物与VGAT的分子相互作用并确立其对囊泡GABA转运的影响，从而支持潜在VGAT靶向化学先导的开发。