# 中文标题 基于孔径依赖的足细胞与胚胎肾间质祖细胞跨膜共培养体系：促进足细胞分化并调节多柔比星诱导损伤反应

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Co-culture with embryonic renal stromal progenitor cell enhances podocyte differentiation and modulates doxorubicin-induced injury responses

　　

# 摘要翻译

足细胞（podocyte）是维持肾脏肾小球滤过屏障（glomerular filtration barrier）选择通透性的特化上皮细胞。然而，传统的足细胞单培养（mono-culture）系统往往缺乏完全支持足细胞分化所需的细胞微环境。肾间质祖细胞（renal stromal progenitor cells, rSPCs）参与肾小球（glomerular）发育并产生包括系膜细胞（mesangial cells）在内的基质衍生物，提示它们可能提供能够支持足细胞分化的发育线索（developmental cues）。因此，本研究在基于膜（membrane-based）的共培养系统中，探究了热敏感小鼠足细胞（heat-sensitive mouse podocytes, HSMPs）与小鼠胚胎期rSPCs共培养对足细胞分化与功能的影响。研究人员将足细胞单独培养，或与分选得到的胚胎期rSPCs共同培养于不同孔径（0.4 μm和8 μm）的多孔膜（porous membranes）上。结果显示，在8 μm膜上进行rSPCs共培养显著增强了足细胞标志物（marker）的表达并促进了足细胞样形态（podocyte-like morphology），这可能是由于细胞间相互作用得到改善所致。该共培养模型维持了大小选择性通透性（size-selective permeability），并表现出对多柔比星（doxorubicin）诱导损伤的独特的剂量依赖性反应（dose-dependent response），提示rSPCs可调节足细胞对毒性应激（toxic stress）的敏感性。这些发现表明，胚胎期rSPCs提供了一个支持性微环境，可增强足细胞分化与稳定性，为研究肾小球发育和损伤提供了更具生理学相关性（physiologically relevant）的体外模型。

# 论文解读

## 一、研究背景、现存问题与研究动机

足细胞是覆盖于肾小球毛细血管袢外表面的特化上皮细胞，与肾小球内皮细胞及肾小球基底膜共同构成肾小球滤过屏障，允许水和小分子溶质通过，同时限制血浆蛋白等大分子的渗漏。足细胞的功能依赖于其独特的细胞架构，包括相互交错的足突、裂孔隔膜相关蛋白及高度有序的细胞骨架，因此足细胞的损伤、去分化或丢失与肾小球屏障功能障碍和蛋白尿性肾脏疾病密切相关。体外足细胞模型是研究肾小球发育、滤过功能及药物诱导足细胞损伤的重要工具，其中条件永生化足细胞细胞系可在许可条件下扩增并在非许可条件下诱导分化，人诱导多能干细胞（hiPS）分化方案及肾脏类器官（kidney organoids）也逐步发展。然而，目前许多体外足细胞模型仍存在明显局限：细胞成熟不完全、细胞间相互作用不足，难以重现发育中肾小球的多细胞微环境；肾脏类器官常表现出不成熟的细胞状态，且支持性的血管与基质成分代表性有限，限制了其完整重现肾小球结构与功能的能力。

在肾脏发育过程中，肾单位形成受肾单位祖细胞（nephron progenitor, NPC）、输尿管芽（ureteric bud, UB）来源上皮结构、内皮细胞与rSPCs之间协调互作的调控。rSPCs并非被动的支持细胞，而是主动参与肾脏形态发生、肾单位模式化及特化基质衍生物形成的重要细胞群体，可产生系膜细胞等具有重要功能意义的肾基质谱系。已有研究证实，rSPCs中的Notch信号通路是小鼠肾脏发育过程中系膜细胞形成所必需的；将NPC、UB与rSPCs组合的类器官重建系统也能生成更具器官特征的肾脏结构，提示rSPCs提供了上皮细胞无法完全替代的发育信号。尽管rSPCs已被引入类器官与重建肾脏模型，但其在适用于滤过相关分析的足细胞单层共培养系统中的应用仍然有限。因此，研究人员建立了基于多孔膜的HSMP-rSPC共培养模型，以评估足细胞分化、基质-足细胞相互作用、大小依赖通透性以及多柔比星诱导损伤反应。

## 二、主要研究结论与意义

研究人员通过流式细胞术从小鼠胚胎肾脏中分选rSPCs，将其与HSMPs在0.4 μm和8 μm两种孔径的Transwell膜上共培养14天，结合qPCR、免疫荧光、扫描电镜（SEM）、FITC-葡聚糖通透性实验及多柔比星剂量-反应分析，得出以下核心结论：在8 μm膜上的rSPCs共培养可显著上调包括Wt1在内的足细胞相关标志物表达并增强SYNPO蛋白信号，促进足细胞样分化；该共培养模型维持了大小选择性通透性，并表现出与单培养不同的多柔比星剂量依赖性损伤反应。这一膜基共培养系统为研究基质-足细胞相互作用及肾小球发育与损伤提供了更具生理学相关性的体外平台。

## 三、主要关键技术与方法

研究人员主要采用以下关键方法：其一，利用生物素化整合素α8（ITGA8）抗体与APC偶联的抗CD140a（PDGFRα）抗体，通过流式细胞分选（Cell Sorter）从小鼠（C57BL/6JJcl，E18.5）胚胎肾脏中分选PDGFRα⁺的rSPCs群体，并以qPCR检测Six2与Foxd1验证分选效率；其二，构建基于Transwell多孔膜（孔径0.4 μm与8 μm）的共培养体系，足细胞接种于顶端（模拟尿腔），rSPCs接种于基底侧（模拟毛细血管腔），分化培养14天；其三，采用qPCR检测足细胞标志物（Nphs1、Wt1、Podxl、Synpo）及基质分化标志物（Acta2、Pdgfrb）；其四，运用免疫荧光染色检测SYNPO、WT1、ACTA2及F-actin，并借助扫描电镜观察细胞突起与膜孔的相互作用；其五，采用不同分子量（4、40、70 kDa）FITC-葡聚糖评估大小依赖通透性；其六，以梯度浓度的多柔比星处理细胞，通过Calcein-AM染色与四参数logistic模型计算IC₅₀评估剂量依赖性毒性反应。

## 四、研究结果

**（1）rSPCs分选。** 研究人员利用ITGA8与PDGFRα抗体进行流式分选：ITGA8⁺/PDGFRα^?群体鉴定为NPC，PDGFRα⁺（红门群体）鉴定为rSPCs。qPCR分析显示，分选后NPC样品中Six2（NPC标志物）表达显著升高，rSPCs样品中Foxd1（rSPCs标志物）表达较高，证实两种细胞均被分选至正确群体。

**（2）共培养对基因表达的影响。** 在0.4 μm膜条件下，共培养组Wt1表达较单培养组略升，Nphs1与Synpo无明显差异，Podxl表达略降。在8 μm膜条件下，除Podxl外大多数足细胞标志物上调，其中Wt1表达显著增加，Nphs1与Synpo亦小幅升高，提示rSPCs共培养可能促进HSMP来源足细胞的分化或成熟。基质分化标志物分析显示，共培养后Acta2表达显著上调而Pdgfrb表达下调，提示rSPCs发生了部分基质分化，但仅凭这些标志物尚无法明确其分化的具体基质细胞亚型。

**（3）共培养对蛋白标志物表达的影响。** qPCR中上调的SYNPO与WT1经免疫荧光验证：8 μm膜共培养组SYNPO信号更强且可见清晰的WT1阳性细胞；同时观察到明确的ACTA2阳性基质/系膜样细胞，且WT1阳性细胞位于ACTA2阳性区域附近或内部，提示足细胞谱系细胞与基质细胞间存在可能的相互作用。0.4 μm膜条件下仍可检测到SYNPO阳性细胞，但WT1表达较弱，提示有限的物理相互作用削弱了rSPCs对足细胞分化的支持作用。扫描电镜观察显示，0.4 μm膜孔过小而不允许明显的细胞突起延伸，细胞铺展并覆盖膜表面；8 μm膜则存在可延伸进入或穿过膜孔的细胞突起样结构，且该结构尺寸大于0.4 μm膜孔径，支持"较大膜孔增强的细胞间相互作用促进足细胞分化"的观点。

**（4）足细胞屏障功能分析。** 研究人员首先以不同分子量葡聚糖检测空膜，24 h后膜上下室葡聚糖浓度趋于一致，证实扩散充分且检测时长适宜。随后分别检测单培养与共培养条件下的足细胞层：两组中4 kDa小分子葡聚糖均可通过细胞层，而40 kDa与70 kDa大分子受到更强限制。尽管共培养与单培养相比未显示明显差异，但共培养模型仍维持了大小依赖通透性，提示该系统保留了足细胞层的选择性通透特性，但并未显著改善通透性。

**（5）多柔比星诱导损伤的剂量依赖性反应。** 免疫荧光显示，单培养条件下多柔比星处理导致足细胞层明显破坏，细胞密度降低、SYNPO表达减弱、F-actin结构紊乱；而共培养组在同等处理下足细胞层保存更好，SYNPO阳性细胞与F-actin结构组织更清晰，且存在ACTA2阳性基质/系膜样细胞。Calcein-AM阳性面积定量分析显示，单培养足细胞活力在较低多柔比星浓度下下降更快，共培养则呈现活力下降延迟，表明rSPCs共培养可能调节早期多柔比星诱导损伤，共培养模型对多柔比星诱导损伤表现出更强的抵抗力，提示rSPCs可能通过调节足细胞微环境增强足细胞层在药物诱导损伤下的稳定性。

## 五、讨论部分总结

讨论指出，qPCR与免疫荧光结果一致表明8 μm膜共培养上调了足细胞相关标志物，尤其是Wt1，而0.4 μm膜效应较弱，膜孔径对于实现足细胞与SP细胞间更紧密的相互作用十分重要，直接或近直接的细胞间通讯可能有助于足细胞分化。就上调机制而言，胚胎rSPCs可能提供肾小球发生过程中正常存在的发育信号，肾基质细胞通过WNT、BMP、FGF、Notch及PDGF相关信号通路主动调节肾发生。WT1是肾脏发育、NPC调控与足细胞身份的关键转录因子，其减少或功能障碍会导致NPHS1与PODXL等足细胞标志物表达下降，因此8 μm共培养条件下WT1的显著增加可能代表重要的上游变化，促进包括NPHS1与SYNPO在内的足细胞分化标志物上调。然而，由于本研究仅分析了标志物表达，确切机制无法确证；鉴于可溶性因子本应可扩散通过两种孔径的膜，8 μm膜的更强效应不太可能仅由整体扩散解释，rSPCs更可能通过局部细胞外基质重塑、基质结合或短程旁分泌信号以及较大膜孔和较高开孔率所实现的接触依赖性线索来增强足细胞标志物表达，扫描电镜显示的细胞突起穿过膜孔为此提供了支持。基质标志物方面，Acta2上调提示rSPCs可能向基质或系膜样表型分化，但Pdgfrb未升高使其分化状态仍不明确，且系膜细胞发育受Notch等特定通路调控，故尚不能得出rSPCs分化为成熟或正确特化系膜细胞的结论。多柔比星实验中，单培养与共培养对药物应激反应不同，但由于多柔比星仅施加于基底侧以模拟血管侧暴露，所观察到的差异可能不仅反映足细胞敏感性改变，还可能涉及药物扩散、摄取或潴留的变化，因此结果应解读为共培养系统在定向基底侧暴露下的独特剂量依赖性反应，而非足细胞均匀保护的直接证据；既往间充质基质细胞研究报道了通过旁分泌机制（如VEGF介导的促存活信号）对足细胞的保护作用，rSPCs作为肾基质与系膜谱系的发育相关细胞，可能创造了调节足细胞损伤反应的肾脏特异性基质微环境，但由于基质-足细胞相互作用具有情境与密度依赖性（过度的系膜谱系增殖及细胞外基质积累反而可促进肾小球硬化并继发足细胞损伤），rSPCs可能起调节而非均匀保护作用。研究局限性包括：HSMPs作为条件永生化足细胞细胞系可能无法完全重现体内成熟足细胞表型，有待更成熟足细胞类型验证；rSPCs向系膜谱系的分化未获特异性证实；未直接评估裂孔隔膜（slit diaphragm）完整性，未来需检测nephrin与ZO-1等标志物；多柔比星处理与FITC-葡聚糖通透性分析作为独立终点进行，损伤是否直接改变通透性尚不清楚，未来需优化联合检测；缺乏内皮细胞与生理流动条件也限制了通透性检测的生理学相关性。

## 六、研究结论

总之，共培养胚胎期rSPCs以孔径依赖方式增强了足细胞相关标志物表达并促进了足细胞样特征。该共培养模型维持了大小依赖性葡聚糖通透性，并表现出与单培养不同的多柔比星诱导损伤反应。尽管仍需进一步完善以重现成熟的肾小球滤过屏障，但这种基于膜的HSMP-rSPC共培养系统为研究基质-足细胞相互作用（stromal-podocyte interactions）提供了有价值的平台。