ESRRG协调视网膜母细胞瘤谷氨酰胺依赖性与线粒体代谢灵活性的转录及代谢机制研究

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Estrogen-related receptor gamma coordinates glutamine dependence and mitochondrial metabolic flexibility in retinoblastoma

　　

癌细胞经历广泛的代谢重编程，当葡萄糖来源的碳被分流至乳酸生成时，可变得依赖谷氨酰胺以补充三羧酸（TCA）循环，然而协调这一反应的转录程序仍未被完全阐明。研究人员先前鉴定雌激素相关受体γ（estrogen-related receptor gamma, ESRRG）为视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, Rb）缺氧适应的驱动因子，本研究进一步表明ESRRG亦调控谷氨酰胺响应性代谢。ESRRG敲低（knockdown）减弱了与糖酵解（glycolysis）及谷氨酰胺利用（glutamine utilization）相关的转录程序，而药理学抑制（pharmacological inhibition）使用GSK5182可衰减谷氨酰胺依赖的细胞活力（cell viability）与存活。反之，ESRRG过表达（overexpression）增加了间充质干细胞（mesenchymal stem cells）对谷氨酰胺撤除（glutamine withdrawal）的敏感性。在功能层面，谷氨酰胺增强了Rb细胞的基底呼吸（basal respiration）、最大呼吸（maximal respiration）、备用呼吸容量（spare respiratory capacity）及ATP关联呼吸（ATP-linked respiration），而上述反应在GSK5182处理后被减弱。靶向液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）分析进一步显示，ESRRG抑制后谷氨酰胺响应性的细胞内谷氨酰胺（glutamine）、谷氨酸（glutamate）、α-酮戊二酸（α-ketoglutarate）及下游TCA相关代谢物积累减少。这些发现将ESRRG鉴定为Rb中谷氨酰胺依赖性与线粒体代谢灵活性的调节因子，并将ESRRG相关谷氨酰胺依赖性提名为一种潜在的代谢脆弱性（metabolic vulnerability）。

癌细胞代谢以广泛的重编程为特征，其中最具代表性的便是尽管氧气充足仍将葡萄糖优先转化为乳酸的有氧糖酵解（aerobic glycolysis）。这种转变导致线粒体对葡萄糖来源碳的利用减少，使细胞转而依赖替代底物维持三羧酸（TCA）循环。谷氨酰胺可通过生成谷氨酸及α-酮戊二酸（α-ketoglutarate）进入TCA循环，支持生物合成、氧化还原平衡及ATP生成。虽然谷氨酰胺通常被视为非必需氨基酸，但肿瘤细胞的消耗可远超生物合成需求，从而在胞外谷氨酰胺缺乏时形成依赖。缺氧及RB1缺失、MYCN扩增等遗传学改变均可上调谷氨酰胺转运体（如ASCT2）和谷氨酰胺酶（GLS）活性以增强谷氨酰胺利用。然而，将糖酵解与线粒体氧化代谢及谷氨酰胺响应相耦合的上游转录协调机制，尤其是孤儿核受体的作用，尚未被充分定义。研究人员先前发现，雌激素相关受体γ（estrogen-related receptor gamma, ESRRG）是严重缺氧下视网膜母细胞瘤（retinoblastoma, Rb）细胞存活的依赖性因子，并在缺氧适应中被强烈诱导。鉴于ESRRG在其他代谢活跃组织中可调控氧化代谢与线粒体功能，研究人员假设ESRRG亦可能在Rb中协调谷氨酰胺响应性线粒体代谢，从而填补RB1缺失与谷氨酰胺响应性代谢表型之间的机制空白。

为验证该假设，研究人员采用互补的遗传学及药理学手段，系统解析了ESRRG相关转录程序、谷氨酰胺依赖性生长、线粒体呼吸及TCA相关代谢物稳态丰度。研究表明，ESRRG是Rb细胞响应胞外谷氨酰胺的关键调节因子：转录层面，ESRRG敲低显著削弱糖酵解及谷氨酰胺代谢基因集；功能层面，药理学抑制ESRRG可降低细胞活力及线粒体呼吸对胞外谷氨酰胺的依赖，而过表达ESRRG则使间充质干细胞对谷氨酰胺撤除更为敏感；代谢层面，靶向代谢组学证实ESRRG抑制减少了谷氨酰胺响应性代谢物积累。这些发现将ESRRG鉴定为Rb中谷氨酰胺依赖性与线粒体代谢灵活性的新型调节因子，扩展了研究人员先前关于RB1缺陷Rb中ESRRG依赖性的发现，也为将ESRRG相关谷氨酰胺依赖性视为潜在代谢脆弱性（metabolic vulnerability）提供依据。

本研究队列包括经University of Miami机构审查委员会批准的三株患者源性Rb细胞系（RB006、RB036和WRb06），以及购自ATCC的牙髓源性间充质干细胞。关键技术方法包括：基于shESRRG与shGFP对照的RNA-测序（RNA-sequencing）及基因集富集分析（gene set enrichment analysis, GSEA），用于定义ESRRG相关转录程序；GSK5182药理学抑制联合谷氨酰胺撤除/补充实验，通过BOBO-3碘化物染色（BOBO-3 iodide staining）和CellTiter-Glo ATP活力检测评估细胞存活；Seahorse XF线粒体压力测试测定氧消耗率（oxygen consumption rate, OCR）和细胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）；靶向液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）分析谷氨酰胺及TCA循环代谢物；以及慢病毒介导的ESRRG功能获得性突变体在间充质干细胞中的过表达。

3.1 ESRRG regulates transcriptional programs associated with glycolysis and glutamine metabolism
RNA-测序与GSEA显示，ESRRG敲低导致糖酵解和中心碳代谢基因集显著负富集（NES = ?1.5, FDR<0.01），MCT1和PDK1等基因表达降低；氧化磷酸化基因集无显著改变。谷氨酰胺代谢基因集亦显著负富集（NES = ?1.9, FDR<0.001），涉及谷氨酰胺摄取、谷氨酸产生及TCA循环整合，为ESRRG影响谷氨酰胺响应提供转录基础。

3.2 Pharmacologic ESRRG inhibition attenuates glutamine-dependent viability in retinoblastoma cells
谷氨酰胺撤除48小时后，对照Rb细胞出现进行性死亡和ATP活力下降；GSK5182处理减弱死亡并维持ATP活力。浓度依赖性实验中，对照细胞随谷氨酰胺浓度（0–8 mM）升高而增殖，GSK5182处理则消除该响应。过表达含VXXLYD结构域RB1结合缺陷突变的ESRRG（MSC[ESRRG-OE]）使间充质干细胞在谷氨酰胺撤除后活力显著下降，并呈现浓度依赖性增殖，表明ESRRG活性升高足以建立谷氨酰胺响应状态。

3.3 ESRRG supports glutamine-responsive mitochondrial respiration
Seahorse XF线粒体压力测试显示，谷氨酰胺补充增加对照Rb细胞的基底呼吸、ATP关联呼吸、最大呼吸及备用呼吸容量。GSK5182处理显著减弱这些增强，使细胞在谷氨酰胺缺乏时维持与充足对照相当的呼吸水平，表明ESRRG抑制降低了线粒体呼吸对胞外谷氨酰胺的依赖。ECAR分析显示GSK5182轻微降低基础ECAR，并在寡霉素（oligomycin）处理后消除谷氨酰胺诱导的ECAR增加。

3.4 ESRRG promotes glutamine-responsive accumulation of TCA cycle metabolites
靶向LC-MS/MS显示，GSK5182处理削弱谷氨酰胺响应性代谢物积累：谷氨酰胺积累减少93.7%，谷氨酸减少54.5%，α-酮戊二酸减少25.3%，柠檬酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐及丙酮酸亦减少。在0–8 mM谷氨酰胺范围内，对照细胞呈现谷氨酰胺、谷氨酸及α-酮戊二酸的剂量依赖性增加，而GSK5182处理组该响应显著减弱，表明ESRRG支持细胞对胞外谷氨酰胺的协调代谢反应。

讨论指出，ESRRG在骨骼肌、心脏及神经元等组织中具有调控氧化代谢与线粒体功能的既定作用，并在癌症中参与糖酵解、呼吸及底物利用的转录网络调节。本研究中ESRRG敲低虽削弱糖酵解及谷氨酰胺利用相关转录程序，但氧化磷酸化基因集未显著改变，提示ESRRG抑制后的线粒体呼吸表型并非由电子传递链基因直接转录调控解释，而可能涉及PGC-1α/PGC-1β共激活或SMILE/SIRT1共抑制等辅调节环境的作用。GSK5182处理并未简单降低所有条件下的活力，而是在谷氨酰胺撤除时维持活力，并限制补充谷氨酰胺带来的额外生长效应，说明ESRRG抑制的核心是解耦细胞生长与谷氨酰胺可利用性。呼吸方面，谷氨酰胺剥夺下GSK5182处理细胞仍能维持基础呼吸和ATP产生，表明其降低了呼吸对胞外谷氨酰胺的依赖，而非全局性抑制线粒体功能。代谢物分析显示ESRRG抑制主要影响谷氨酰胺处理的近端步骤（谷氨酰胺→谷氨酸→α-酮戊二酸），并延伸至下游TCA相关代谢物，但稳态丰度无法区分摄取、合成或转化差异，未来需借助¹³C-谷氨酰胺示踪以明确碳流向。综上所述，本研究结论认为ESRRG是Rb中连接缺氧适应、RB1缺失与谷氨酰胺响应性代谢状态的关键节点，其功能不仅支持线粒体代谢灵活性，更将ESRRG相关谷氨酰胺依赖性确立为一种具有潜在治疗价值的代谢表型，但其在体内肿瘤中的预测价值及治疗可转化性仍需临床前模型进一步验证。