《Bioorganic Chemistry》：Inhibition of CYP19A1 aromatase and suppression of estradiol production by polyhalogenated carbazoles: an in vitro and in silico study
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•PHCZs 通过一种混合机制抑制 CYP19A1，而不直接竞争底物。•3D-QSAR 确定 HBA 和疏水性特征对于抑制作用是必需的。•BeWo 细胞实验确认 PHCZs 可抑制雌激素的产生，且不具有细胞毒性。•网络毒理学分析表明 CYP19A1 是连接 PHCZs 与多囊卵巢
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PHCZs 通过一种混合机制抑制 CYP19A1，而不直接竞争底物。
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3D-QSAR 确定 HBA 和疏水性特征对于抑制作用是必需的。
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BeWo 细胞实验确认 PHCZs 可抑制雌激素的产生，且不具有细胞毒性。
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网络毒理学分析表明 CYP19A1 是连接 PHCZs 与多囊卵巢综合征 (PCOS) 和骨质疏松症的关键因素。
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双变量相关性分析显示 LogP 和 pKa 是活性的关键物理化学决定因素。
引言
多卤代咔唑 (PHCZs) 是一类新兴的环境污染物，由于其广泛存在、持久性和潜在的毒理学风险而受到越来越多的关注 [1]、[2]。PHCZs 在结构上类似于多氯二苯并呋喃和二噁英，它们既可以通过自然过程（如真菌代谢和光化学反应）产生，也可以通过人为活动产生，包括染料、药品、农业化学品和卤化阻燃剂的生产 [2]、[3]、[4]、[5]。迄今为止，已在世界各地的环境样本中（包括沉积物、土壤、地表水和生物体）鉴定出 20 多种 PHCZ 同系物 [2]、[4]。其中，1,3,6,8-BCZ、3,6-BCZ 和 3,6-CCZ 在河流沉积物和水生生物中的浓度范围从纳克到微克/克不等 [4]、[6]、[7]。此外，最近的生物监测研究显示人类血清、母乳和脂肪组织中也能检测到 PHCZs，这表明普通人群可能通过饮食摄入和环境接触长期暴露于这些物质 [1]、[3]、[8]。随着对它们的环境持久性和生物累积潜力的认识不断提高，人们也越来越意识到接触这些污染物会扰乱代谢和脂质稳态 [9]、[10]。因此，与 PHCZ 暴露相关的健康风险已成为环境健康研究中的一个日益关注的课题。
环境化学物质已被证实会干扰下丘脑-垂体-卵巢 (HPO) 轴并破坏激素稳态 [11]。然而，在各种令人担忧的毒理学终点中，PHCZs 的内分泌干扰潜力仍知之甚少。从结构上看，PHCZs 包含一个咔唑骨架，其卤素取代的程度和位置各不相同，这些因素对它们的化学行为起着关键作用 [12]，并赋予它们特定的物理化学性质（如亲脂性、代谢稳定性和分子平面性），从而影响与类固醇生成酶和激素受体的相互作用 [3]、[13]。其中一个关键目标是芳香化酶 (CYP19A1)，这是一种细胞色素 P450 酶，可催化雄激素（睾酮和雄烯二酮）向雌激素（雌二醇和雌酮）的转化 [14]。CYP19A1 主要表达在胎盘、卵巢、睾丸、脂肪组织和大脑中，在生殖发育、骨骼稳态和神经内分泌功能中发挥着重要作用 [15]。CYP19A1 活性的破坏会导致雌激素生物合成减少，进而引发一系列疾病，包括多囊卵巢综合征 (PCOS)、骨质疏松症和雌激素依赖性癌症 [16]、[17]。
PCOS 是影响育龄妇女的最常见的内分泌疾病之一，全球患病率估计为 6–20% [18]。PCOS 的病理生理特征是雄激素过多、慢性无排卵和多囊卵巢形态，越来越多的证据表明芳香化酶活性降低是雄激素积聚的关键因素 [19]、[20]。事实上，CYP19A1 基因的遗传多态性和表观遗传修饰与 PCOS 的易感性有关，而雷佐诺尔 (letrozole) 对 CYP19A1 的药理学抑制已被广泛用于建立类似 PCOS 的动物模型 [21]、[22]、[23]。除了生殖功能障碍外，由于 CYP19A1 活性受损导致的雌激素缺乏也是骨质疏松症的主要病因之一，因为雌激素通过调节成骨细胞和破骨细胞的活性在维持骨密度方面起着关键作用 [24]。临床和流行病学研究一致表明，雌激素生物合成减少（无论是由于绝经、芳香化酶缺乏还是治疗性芳香化酶抑制）都会显著增加骨质流失和骨折的风险 [25]、[26]。此外，代谢紊乱已被证实会严重破坏内分泌稳态，从而加剧激素相关病理的严重程度 [27]。综上所述，CYP19A1 成为连接环境化学物质暴露与生殖和骨骼疾病的关键纽带。
尽管先前的研究已经报道了 PHCZs 的一般内分泌干扰作用 [13]，但它们直接与关键类固醇生成酶（如 CYP19A1）相互作用并抑制其活性的潜力仍很大程度上未被探索。先前的研究表明，结构相关的卤代化合物（如多氯联苯、多溴联苯醚和双酚类似物）可以以结构依赖的方式抑制 CYP19A1 的活性 [28]、[29]、[30]。这些发现强调了系统评估 PHCZs（作为一种具有多种取代模式的卤代芳香化合物）是否同样会干扰 CYP19A1 活性和下游雌激素生物合成的必要性。
为填补这一知识空白，本研究结合了酶学、细胞学和计算机模拟方法，系统地研究了 PHCZs 对 CYP19A1 的抑制作用。虽然外源性物质的体内生物学效应很大程度上受其药代动力学特性和生物利用度的影响 [31]，但阐明它们与靶酶的直接分子相互作用是进行风险评估的基本前提。因此，我们首先筛选了一组 11 种具有不同环境普遍性和卤素取代模式的 PHCZ 同系物，对其对人胎盘中芳香化酶的抑制活性进行了检测，随后对最有效的抑制剂进行了详细的动力学分析。通过网络毒理学分析确定了 PHCZ 目标和疾病相关基因之间的关联，这种方法最近被证明对于 decipher 污染物-靶标相互作用非常有效 [32]、[33]，从而为 CYP19A1 的作用机制提供了初步的证据。随后使用 BeWo 细胞实验来研究其功能相关性。最后，通过分子对接、分子动力学模拟和 3D-QSAR 药效团建模，阐明了 PHCZ-CYP19A1 相互作用的分子机制，并确定了决定抑制效力的关键结构特征，从而为这类环境污染物建立了全面的结构-活性关系 (SAR) 分析 [34]、[35]。通过这种综合方法，本研究旨在首次提供直接证据，证明 PHCZs 可抑制 CYP19A1，从而扩展了已知的对 PHCZ 引发的内分泌干扰机制，并为评估其对生殖和骨骼健康的潜在风险提供了机制见解。
章节摘要
化学品和试剂
睾酮 (T) 和雌二醇 (E2) 从 Steraloids (Newport, RI, USA) 购买。NADPH、二甲基亚砜 (DMSO) 和磷酸盐缓冲盐 (PBS, pH 7.2) 从 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 购买。多卤代咔唑包括咔唑 (CZ, CAS 86-74-8, 纯度 >99%)、3-氯咔唑 (3-CCZ, CAS 2732-25-4, 纯度 >98%)、3,6-二氯咔唑 (36-CCZ, CAS 5599-71-3, 纯度 >98%)、3-溴咔唑 (3-BCZ, CAS 1592-95-6, 纯度 >98%)、3,6-二溴咔唑
多卤代咔唑抑制人胎盘中 CYP19A1 的活性
我们首先确定了人胎盘中 CYP19A1 的酶动力学参数。Michaelis-Menten 分析显示，CYP19A1 将睾酮转化为雌二醇的 Km 值为 0.07 μM，Vmax 值为 3804 ± 111.5 pmol/mg/min（图 1A）。为了筛选多卤代咔唑的抑制活性，我们测试了 11 种化合物在 100 μM 浓度下的效果（图 1B）。结果表明，只有 136-BCZ、1-B-36-CCZ 和 36-ICZ 在抑制活性上表现显著
讨论
多卤代咔唑 (PHCZs) 被认为是具有二噁英样毒性的持久性环境污染物 [2]、[4]，先前的研究已经证明了它们的一般内分泌干扰作用 [13]。然而，它们是否直接干扰关键类固醇生成酶仍不清楚。在这里，我们证明了 PHCZs 直接抑制 CYP19A1，即雌激素生物合成中的限速酶。在筛选的 11 种同系物中，只有 136-BCZ、1-B-36-CCZ 和 36-ICZ 表现出抑制作用
CRediT 作者贡献声明
Jianmin Sang：撰写——初稿、方法学、正式分析。Zicheng Yang：方法学、正式分析。Xuewei Ding：方法学、研究、资金获取。Ruizi Gao：软件、研究。Chengtao Lei：方法学、研究。Long He：方法学、研究。Liu Lu：软件、资源。Shanshan Yu：软件、方法学。Ming Zong：监督、资金获取。Lieying Fan：撰写——审阅与编辑、方法学、资金获取。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本项工作部分得到了 国家自然科学基金（项目编号：81971535）的支持，资助者为 L.Y.F.
Jianmin Sang|Zicheng Yang|Xuewei Ding|Ruizi Gao|Chengtao Lei|Long He|Liu Lu|Shanshan Yu|Ming Zong|Lieying Fan
