《Bioresource Technology》：Rational design of thermophilic catechol 2,3-dioxygenase via a site-polarity-switch to enhance synergistic bioremediation of catecholic contaminants
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•来自不同嗜热菌株的C23Os表现出功能专业化。•残基152被确定为控制底物选择性的“极性开关”。•L152T变体对4-氯邻苯二酚的活性提高了8倍。•关键位点的极性开关通过密集的氢键稳定了Fe-O几何结构。•野生型与工程改造的C23O组合使用可协同降解邻苯二酚混合物。引言芳香化合
• 来自不同嗜热菌株的C23Os表现出功能专业化。
• 残基152被确定为控制底物选择性的“极性开关”。
• L152T变体对4-氯邻苯二酚的活性提高了8倍。
• 关键位点的极性开关通过密集的氢键稳定了Fe-O几何结构。
• 野生型与工程改造的C23O组合使用可协同降解邻苯二酚混合物。
引言 芳香化合物，尤其是酚类衍生物，是普遍存在的环境污染物，来源于石油精炼、制药生产和染料生产（Fuchs等人，2011年；Su等人，2025年）。在芳香化合物的有氧降解途径中，苯类底物及其类似物的氧化环裂解是实现完全矿化的关键限速步骤（Hutskalova和Sparr，2025年；Lipscomb，2008年；Tu等人，2020年）。邻苯二酚2,3-双加氧酶（C23Os）利用非血红素金属离子作为辅因子，催化各种二羟基芳香中间体的元 裂解（Lipscomb，2008年）。与其他环裂解酶（例如邻苯二酚1,2-双加氧酶）相比，C23Os具有更广泛的底物谱和更高的催化多样性，使其成为修复复杂、多源芳香污染物的高效生物催化剂（Cho等人，2010年；Yang等人，2024年；Zhang等人，2023年）。然而，工业 wastewater 中很少只含有单一污染物；实际上它包含 substituted phenols、多环芳烃以及邻苯二酚及其衍生物的复杂混合物（Qiu等人，2025年）。因此，需要能够在恶劣工业条件下（如高温度）保持稳定性的强效生物催化剂，同时具备高催化效率和广泛的底物适应性（Tu等人，2020年；Yang等人，2024年）。大多数已研究的C23Os是中温菌株，且容易因高温而迅速失活（Takeo等人，2007年；Tuan等人，2013年；Vaillancourt等人，2005年）。因此，嗜热微生物及其耐受压力的酶成为极端环境生物修复的有希望的候选者。
然而，天然进化的嗜热野生型C23Os通常具有狭窄的底物谱和有限的催化效率，这限制了它们在复杂废水处理中的应用（Yin等人，2026年）。此外，嗜热C23Os在不同底物上的催化性能存在显著差异，使得混合污染物的平衡降解变得复杂，表明依赖单一生物催化剂可能不足（Li等人，2024年；Singh和Ramanathan，2025a；Singh和Ramanathan，2025b）。目前，关于C23O底物选择性的分子机制（包括C末端尾部的顺序截断、活性口袋的立体重塑以及氢键网络的重排）主要基于对中温菌株的同源物的研究（Karshikoff等人，2015年；Siani等人，2006年；Takeo等人，2007年；Vasudeva等人，2025年）来确定。嗜热酶是否利用了不同的结构特征（如极性驱动的氢键重塑而非单纯的立体修饰）来适应多种底物，仍然是一个重要的知识空白，这极大地限制了它们的合理工程设计和功能组合。此前有报道称某些嗜热菌株具有强大的芳香化合物降解能力，基因组分析显示这些菌株编码了多种嗜热C23Os（Sun等人，2023年；Sun等人，2024年；Li等人，2024年）。值得注意的是，这些同种酶的冗余性被认为导致了不同的催化流分布，意味着它们对各种邻苯二酚取代基具有功能专业化（Yin等人，2026年）。
在这项研究中，从W-12和W-36中分离出了四个C23O基因，用于系统克隆和生化表征。基于表征结果，对W-36中的C23O-1594骨架进行了合理的设计。通过结构分析和分子对接确定了控制底物选择性的关键残基，然后通过定点突变明确了活性位点极性的影响。接着使用分子动力学模拟阐明了内在机制。最后，提出了一种多酶策略来实现混合邻苯二酚底物的协同矿化。
章节摘录 菌株和质粒 从两种能够降解酚类的嗜热菌
A. pallidus W-12（GenBank: SRX5313811）和
P. thermoglucosidasius W-36（GenBank:
CP184786 ）的基因组中挖掘出了嗜热C23O基因。基因组注释发现了多个潜在的C23O同种酶，从中选出了四个候选基因（orf-1594、orf-1866、orf-2088、orf-3685）（Yin等人，2026年）。
Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)分别用于克隆和蛋白质表达。从菌株基因组DNA中扩增的目标编码序列
C23O同种酶的底物特异性和催化偏好 对W-12和W-36的基因组分析以及我们之前的研究表明，这两种菌株都编码了几种邻苯二酚2,3-双加氧酶（C23O）同种酶。这种冗余性表明它们可能在降解不同邻苯二酚衍生物方面具有潜在的功能专业化（Sun等人，2023年；Yin等人，2026年）。为了验证这一假设，使用一系列具有不同立体体积取代基的邻苯二酚评估了四种候选C23O（orf-1594、orf-1866、orf-2088和orf-3685）的催化活性。
结论 本研究确定嗜热C23O中的残基152是一个控制底物特异性的极性开关。通过改变活性位点的微环境，L152T变体的催化活性对小体积邻苯二酚及其衍生物提高了2.0到8.0倍。结构分析表明，这种极性驱动的取代增强了局部氢键网络，稳定了底物环裂解所需的Fe-O催化距离。
CRediT作者贡献声明 Shuxin Su： 撰写——初稿、可视化、方法论、研究。Shuo Cheng： 撰写——审阅与编辑、软件、研究、形式分析、数据整理。Yalin Yin： 软件、概念化。Jingjing Zhang： 撰写——审阅与编辑。Rui Zhao： 方法论。Yue Yang： 方法论。Jingjing Liu： 撰写——审阅与编辑。Hengchao Zhu： 软件。Lei Yao： 形式分析。Yiyang Tan： 软件。Wenke Li： 形式分析。Wei Wang： 撰写——审阅与编辑、监督，
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
Shuxin Su|Shuo Cheng|Yalin Yin|Jingjing Zhang|Rui Zhao|Yue Yang|Jingjing Liu|Hengchao Zhu|Lei Yao|Yiyang Tan|Wenke Li|Wei Wang
