基于信息素受体的金刚石生物传感器用于检测入侵性草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda

《Biosensors and Bioelectronics: X》：A pheromone receptor-based diamond biosensor for the detection of the invasive fall armyworm Spodoptera frugiperda

　　

害虫昆虫对农业生产造成显著影响，据估计其直接或间接毁坏全球约五分之一的年度作物产量，造成全球范围内的重大经济损失。此外，受气候变化、耕作方式转变及国际贸易加剧的影响，其对农业的影响预计将进一步加重。除农业损失外，害虫昆虫还对人类健康和粮食安全构成严重威胁。尽管化学农药仍是害虫防治中应用最广泛的手段，但其对非靶标生物和环境具有不利影响。在此背景下，本研究在法国国家资助的Pherosensor项目框架内开展，该项目旨在实现田间害虫的早期检测，以便在种群暴发前进行局部快速处置，从而减少农药用量。种群监测最常用的方法基于信息素诱捕器，其利用性信息素或聚集信息素诱集昆虫。然而，该方法依赖人类专家识别并人工计数害虫，使系统耗时且昂贵。为克服上述局限并提高害虫识别效率，电子诱捕器和人工智能策略正在被开发。其中部分系统利用光学成像和/或振动检测来识别特定昆虫物种的存在。此外，灯光诱捕器的使用亦被考虑。另一种途径是开发能够检测昆虫特异性释放的信息素的高灵敏化学传感器。从长远看，该途径可实现信息素传感器网络的部署，用于农田、森林及城市区域昆虫存在的自动化监测。文献中已报道多种信息素传感器技术，包括以聚苯胺及其衍生物作为敏感涂层的传感器，或金属氧化物半导体传感器，后者有时作为电子鼻技术的一部分。尽管这些传感器已证明对昆虫释放的挥发性有机化合物（VOCs）具有敏感性，但其通常存在灵敏度和特异性较弱的问题。此外，已有研究开发出基于适配体的生物传感器，可特异性结合蝗虫信息素4-乙烯基苯甲醚，其对一系列相关VOCs表现出良好选择性，但灵敏度仅限于低ppm水平。相比之下，基于嗅觉受体（OR）的传感器预期可提供更优的灵敏度和选择性。此类传感器已被报道用于利用哺乳动物OR检测多种气味分子。此外，已有报道利用信息素结合蛋白（PBPs）或信息素受体检测昆虫信息素。生物受体与电化学、场效应晶体管或基于细胞的转导原理相结合，取得了极具前景的结果。在本研究中，研究人员提出一种基于昆虫OR接枝金刚石传感器的创新方法，专门设计用于检测高度入侵性的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的存在。该鳞翅目作物害虫属于夜蛾科，起源于美洲热带和亚热带地区。近年来其已广泛扩散至非洲、亚洲和大洋洲，近期在欧洲亦有报道。草地贪夜蛾的性信息素已从不同地理区域得到表征，均以(Z)-9-十四碳烯基乙酸酯（Z9-14:Ac）为主要组分。相应的信息素受体已被鉴定，即SfruOR13，其通过在非洲爪蟾卵母细胞或果蝇神经元中的异源表达进行功能表征而得到证明。利用该对Z9-14:Ac具有特异性和敏感性的受体，研究人员开发了一种能够通过检测其主要信息素组分来检测草地贪夜蛾存在的生物传感器。SfruOR13蛋白被生产并固定于专门设计的合成金刚石谐振膜上。金刚石机械微结构为生物传感提供优势，包括增强的机械性能，以及允许生物分子高度稳定C-C共价键合的碳表面。此处选择膜结构是因为其具有大表面积，与其他微机电系统（MEMS）结构如悬臂梁不同，从而可能提供与分析物更多的表面相互作用。SfruOR13首先被固定于掺硼金刚石电极上，以通过电化学阻抗谱表征接枝效率。成功的接枝流程随后被应用于金刚石膜，并最终针对Z9-14:Ac检测进行评估。

研究背景方面，害虫昆虫直接或间接毁坏全球约五分之一的年度作物产量，造成重大经济损失，并威胁人类健康与粮食安全；化学农药虽为最广泛使用的防治手段，但对非靶标生物和环境有害。现有种群监测主要依赖信息素诱捕器，需人工识别计数，耗时且昂贵；电子诱捕器、光学成像、振动检测及灯光诱捕等替代手段正在发展；已报道的信息素传感器（聚苯胺涂层、金属氧化物半导体、电子鼻、适配体传感器）普遍存在灵敏度或特异性不足，适配体传感器灵敏度仅限低ppm水平。基于嗅觉受体（OR）的传感器预期具有更优灵敏度和选择性，但已有OR传感器多采用电化学、场效应晶体管或细胞转导，且针对草地贪夜蛾信息素检测的电化学阻抗型传感器灵敏度有限。因此，研究人员在法国Pherosensor项目框架下，针对高度入侵性草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda及其主要性信息素组分Z9-14:Ac，以已鉴定的信息素受体SfruOR13为敏感元件，开发基于金刚石谐振膜的重量型生物传感器，以期实现田间害虫早期检测、减少农药用量。

研究人员开展的工作包括：SfruOR13在大肠杆菌无细胞表达体系中表达并以纳米圆盘稳定；通过4-氨基苯甲酸（4-ABA）电化学接枝、EDC/NHS活化、NTA-Ni²⁺配位将受体固定于掺硼金刚石（BDD）电极并以电化学阻抗谱（EIS）表征各固定步骤；筛选纳米圆盘构型；进而将受体固定于全金刚石谐振膜，以激光多普勒干涉法测量共振频移检测Z9-14:Ac。结论为：受体成功固定并保持生物功能性，传感器对Z9-14:Ac呈线性响应，灵敏度87 mHz fM^?1（345 Hz ng^?1），检测限（LOD）约8.4 fM，且对结构相似的其他信息素具选择性。其意义在于为害虫管理与减少农药使用提供了有前景的检测平台。

关键技术方法：以掺硼金刚石（BDD）电极进行4-氨基苯甲酸电化学接枝与EDC/NHS、NTA-Ni²⁺逐步固定，采用电化学阻抗谱（EIS）表征固定效率与信息素响应；SfruOR13经大肠杆菌无细胞表达并以预组装纳米圆盘（MSP1E3D1+DMPC）稳定；采用微波等离子体化学气相沉积（MP-CVD）生长BDD薄膜并经光刻、深反应离子刻蚀（DRIE）制备金刚石谐振膜；以激光多普勒干涉法测量膜共振频移。样本来源为草地贪夜蛾基因组v3.1（注释OGS2.0）中SfruOR13核苷酸序列，信息素标准品购自Pherobank与ChemTica。

研究结果：3.1 信息素受体固定——通过EIS记录裸BDD电极及各固定步骤后的Nyquist图，得出电荷转移电阻（Rct）由裸电极约65 Ω经4-ABA接枝升至约500 Ω、EDC/NHS活化后降至约290 Ω、NTA与Ni²⁺加入后略升、固定SfruOR13后大幅升至2900 Ω的结论；对照实验表明无Ni²⁺时无显著Rct增加，支持受体经Ni²⁺/His6标签相互作用固定。3.2 纳米圆盘筛选——通过将四种纳米圆盘构型固定的受体电极暴露于40 μM Z9-14:Ac并比较EIS谱，得出各构型Rct均显著增加、以MSP1E3D1+DMPC变化最大的结论；通过暴露于4-甲基-5-壬醇、Z7-12:Ac与Z11-16:Ac，得出Rct平均变化仅约1%、表明对靶标信息素为特异性相互作用的结论。3.3 传感金刚石膜——通过将接枝SfruOR13的金刚石膜暴露于递增浓度Z9-14:Ac并以激光多普勒干涉法测频移，得出响应可重复、0–1 pM范围校准曲线线性优异（R²=0.99）、灵敏度87 mHz fM^?1、LOD约8.4 fM的结论；通过4 pM暴露的瞬态响应，得出动力学符合Langmuir模型指数规律的结论。

讨论部分总结：研究人员将本传感器性能与文献中基于OR的重量型、电化学阻抗型、荧光型及离子电流型传感器进行比较，指出其LOD远低于多数电化学阻抗型OR传感器，与表面声波传感器及场效应晶体管传感器（约1 fM）相近；同时指出结果在受控实验室条件下获得，昆虫OR为高度疏水性膜蛋白，其结构稳定性与功能强烈依赖周围环境，田间应用需维持适宜水相环境，气相信息素需先转移至液相，且可能伴随其他干扰化合物，相关干扰VOCs的识别及其影响尚待进一步研究。研究结论为：SfruOR13可在纳米圆盘中表达并稳定，固定于金刚石表面后仍保持生物功能性，据此开发出性能良好的金刚石谐振器/SfruOR13信息素生物传感器，该传感器在害虫管理与减少农药使用方面具有高度前景。