细胞培养中的微妙平衡：精准调节氨基酸和二肽的配比，以优化培养基配方和生物制造工艺的性能

《Biotechnology Advances》：Cell culture tightrope: Balancing amino acids and dipeptides to optimize media formulation and biomanufacturing performance

摘要
高质量的细胞培养基在哺乳动物生物制造中仍然占据核心地位，因为工业生产越来越复杂的分子，同时需要在高细胞密度和强化处理条件下进行培养。氨基酸是一类关键的培养基成分，它们不仅是内源性和重组蛋白质的构建块，也是细胞代谢的关键调节因子。这要求以挑战其稳定性和溶解度极限的浓度提供氨基酸。本文综述了氨基酸在细胞培养中的作用以及如何选择培养基配方中的最佳浓度，重点是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞。文中描述了利用组学辅助的培养基开发策略来表征氨基酸代谢并最小化由氨基酸降解引起的代谢效率低下问题。此外，还讨论了旨在引入氨基酸营养缺陷或消除代谢瓶颈的基因工程方法作为提高细胞培养性能的补充策略。随着培养基浓度的增加，理解与氨基酸溶解度相关的物理化学限制变得越来越重要。新兴的计算机模拟热力学模型捕捉了氨基酸与其他培养基成分之间的相互作用，这些模型被认为是预测溶解度极限和指导合理培养基配方策略的有价值工具。由于具有更好的溶解度、稳定性和工艺增强特性，二肽正成为游离氨基酸的越来越有吸引力的替代品。因此，本文总结了主要的二肽、目前对其吸收和代谢的认识，以及氨基酸和二肽的转运蛋白和切割酶。最后，本文强调了通过将实验与建模方法相结合来进行智能培养基设计的重要性，以实现高效、稳健和可持续的生物制造过程。

引言
近年来，制药行业经历了扩张和增长，生产了大量生物制药产品。单克隆抗体占据了这一市场的大部分份额，预计到2026年其销售额将超过3000亿美元，并在未来十年内以12.7%的复合年增长率（CAGR）增长（Faizullabhoy和Wani, 2025；Pandey, 2026）。单克隆抗体的生产通常使用哺乳动物细胞培养系统。尽管NS0细胞和小仓鼠肾细胞（BHK）也被用于某些产品，但绝大多数单克隆抗体药物是通过使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞的过程生物制造的（Lu等人，2020）。自1957年从中国仓鼠（Cricetulus griseus）的卵巢组织中分离出原始CHO细胞以来，研究人员对这些细胞系进行了大量改造和工程化，使其具备在悬浮液中生长、实现大规模高细胞密度、产生高滴度重组蛋白以及生成具有理想关键质量属性（包括糖基化）的产品等宝贵特性（Dhara等人，2018）。成功的哺乳动物生物技术的一个关键要素是能够维持和促进细胞生长和蛋白质生产的细胞培养基。细胞培养基不仅决定了细胞培养的性能，还对生物制药制造中的原材料成本有重大影响。这使得细胞培养基开发成为生物技术学家们非常关注的话题。
细胞培养基领域已经从含有血清、蛋白质和其他动物来源成分的发展，进步到cGMP级的、限制蛋白质添加或完全合成的培养基（Ritacco等人，2018；Yao和Asayama，2017）。这些现代培养基配方由化学和结构明确的有机和无机成分组成，包括碳、氮以及其他成分，如葡萄糖、氨基酸、脂质、维生素、微量元素，必要时还包括少量的生长因子（Cordova等人，2023）。精确的细胞培养基组成带来了许多优势，例如易于重复性、降低微生物和病毒污染的风险，以及避免使用血清等动物来源成分所带来的伦理问题。此外，随着不同类型生物制品（如单克隆抗体、双特异性抗体、抗体药物偶联物、病毒载体疫苗等）和生物工艺类型（如批次培养、灌流培养、强化批次培养等）的出现和发展，持续需要理解和开发适合各种工艺的不同培养基平台。
近年来，研究人员采用了几种技术来优化特定任务的细胞培养基配方。传统的改进细胞培养基的方法通常采用简单的经验性逐一因素（OFAT）方法，这种方法在培养基成分众多时相当繁琐。此外，在进行培养基优化研究时还需要考虑多种成分及其复杂的相互作用。通过使用统计建模和实验设计（DOE）技术可以克服这些挑战，这些技术能够以高通量方式考虑多种成分（Ladiwala等人，2023）。同时，基因组规模的代谢模型可以预测氨基酸利用率，并实现对细胞培养过程中营养需求的模型预测控制（Chen等人，2019；Chen等人，2022）。最近，机器学习和人工智能技术（如贝叶斯优化）有助于简化培养基优化过程（Ndahiro等人，2025）。这些方法还可以结合多种“组学平台”，提高我们对细胞代谢和过程特性的理解，并指导策略和决策制定。确实，考虑到各种营养素在决定生物工艺性能中的复杂作用是非常重要的。尽管许多关于生物制造的重要综述文章讨论了生物治疗生产中的关键步骤和创新，但只有少数文章详细讨论了培养基开发。Combe等人之前的综述考虑了细胞培养基开发的一般趋势，并采用定量方法评估培养基对CHO细胞生长和蛋白质生产的影响（Combe和Sokolenko，2021）。其他综述文章则研究了细胞培养基发展的历史，及其当前化学定义的形式，并描述了各种成分的相关性（Ritacco等人，2018；Yao和Asayama，2017）。然而，几乎没有综述专门关注细胞培养基中的特定成分。氨基酸是细胞培养基中的重要成分，因为它们是蛋白质合成和重组蛋白治疗的构建块，在增殖的哺乳动物细胞培养中，它们的干质量占比约为葡萄糖的70%（Hosios等人，2016；Traustason，2019；Yatipanthalawa等人，2026）。优化细胞培养基中的氨基酸水平已被证明可以通过提供必需的营养素来改变细胞代谢、促进细胞生长和存活率、提高蛋白质滴度并改善产品品质属性（Fan等人，2015）。
随着行业向更高细胞密度、强化批次培养和基于灌流的过程转变，对氨基酸的需求大幅增加，使得培养基中的氨基酸浓度接近甚至超过了其溶解度和稳定性极限。鉴于氨基酸在细胞生长、产物滴度和细胞生理中的重要作用，以及在强化生物制造条件下高效输送这些氨基酸所面临的挑战，全面理解氨基酸代谢、物理化学限制以及替代输送策略（如二肽）显得及时且必要（图1）。因此，本文重点讨论了氨基酸在细胞培养基中的作用，探讨了如何在日益浓缩的配方中平衡其代谢需求与稳定性和溶解度的物理化学要求，特别关注CHO细胞，并考虑将基因工程和二肽作为培养基和细胞培养设计的下一代策略。

细胞培养基
虽然早在19世纪末就已经开发出了用于维持和培养原始细胞的培养基，但20世纪50年代细胞系的出现催生了标准化合成培养基的发展，这些培养基至今仍在使用（Yao和Asayama，2017）。Raymond C. Parker、Wilton R. Earle和Charity Waymouth早期尝试创造无血清甚至无蛋白质的培养基时遇到了培养基组成的复杂性问题。此外，这些培养基是为特定的细胞类型优化的。

氨基酸
氨基酸是一类对生命和细胞功能至关重要的有机分子（Wu，2021）。它们可以根据化学、物理和生物学特性进行分类。氨基酸的共同化学特征是一个氨基（?NH2）基团和一个羧基（?COOH）基团，这些基团连接在一个中央的α-碳原子上。除了甘氨酸外，天然氨基酸都是手性的，并在这种立体中心碳原子上呈现L构型。也可以合成D构型的变体。

氨基酸代谢
氨基酸是所有活细胞的基础，因为它们构成了所有蛋白质（如结构蛋白、酶、激素以及工程化重组蛋白质如抗体和病毒载体）的构建块。除此之外，它们还是细胞能量的重要来源，因为它们可以直接或通过代谢中间体进一步分解来生成ATP等能量形式。最后，它们还是其他生物分子的前体。

细胞培养基成分的沉淀和不稳定
为了支持哺乳动物细胞的生长，科学家们确定了所需的必需营养素，开发出了复杂的化学定义的细胞培养基，这些培养基可能包含超过50种化合物，如葡萄糖、氨基酸、维生素、脂质和微量元素（Ritacco等人，2018）。由于对生物制品需求的增加，工艺强度的提高使得需要最大化细胞培养基中的营养含量，尤其是浓缩培养基中的营养含量，这可能导致...

二肽
通过将某些氨基酸与其他氨基酸偶联形成肽键，可以显著提高其稳定性、溶解度和吸收效率。这一原理已应用于肠外营养领域，以化学定义的肽形式为患者提供足够的谷氨酰胺和酪氨酸（Fürst，1998）。与仍作为补充剂的蛋白质水解物相比，二肽可以高纯度和高质量地生产。

二肽的代谢动力学和热力学
特定的二肽能够通过高效导入细胞而促进营养物质的吸收，在细胞内分解为其氨基酸构建块。这一过程有助于提高细胞对二肽的利用效率，从而提高培养的生产力和生长。然而，直到最近，关于其利用动力学的已知知识仍然有限。Christie和Butler发现，特定的肽酶能够水解谷氨酰胺肽Ala-Gln...

氨基酸转运蛋白
为了进入培养的哺乳动物细胞的细胞质和细胞器，氨基酸必须穿过细胞和细胞器膜运输（Kandasamy等人，2018）。不同类别的氨基酸转运蛋白介导这一主动过程，确保细胞内保持适当和平衡的氨基酸水平。这些转运蛋白是跨膜蛋白，通常表现出组织特异性表达，并属于不同的家族，具有特定的功能。

培养基优化策略
细胞培养基优化成为生物制造领域日益关注的话题，原因有很多。首先，含有平衡营养素的最佳配方对于通过有效调节细胞通路来维持生长和生产至关重要。其次，培养基研究可以作为调节代谢和阐明细胞反应的手段，从而定制出具有理想特性的配方。第三，工艺强度的增加要求...

结论与未来展望
生物制造的强化导致营养物质的消耗率进一步上升，以满足培养中的细胞需求。鉴于氨基酸在蛋白质生物合成、能量来源和代谢中间体方面的作用，以适合高产细胞培养过程的形式提供这些氨基酸的需求正在增长。最初，细胞...

手册准备过程中AI辅助的声明
所有科学内容、分析和结论均由作者开发、撰写和批准。在准备手册过程中未使用任何生成式AI。仅使用了有限的AI辅助来检查文本的语言和语法，并由作者进行了验证。

作者贡献声明
Pranay Ladiwala：概念化、可视化、初稿撰写、修订与编辑。
Andreas Kappel：概念化、监督、初稿撰写、修订与编辑。
Jayanth Venkatarama Reddy：可视化、初稿撰写、修订与编辑。
Melanie Schoelzel：概念化、初稿撰写、修订与编辑。Harnish Mukesh Naik：撰写——初稿；撰写——审阅与编辑
Johanna Peters：撰写——利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。

致谢
本项工作部分得到了美国国家科学基金会（Grant number: 2100800）支持下的先进哺乳动物生物制造创新中心（AMBIC）的支持，该中心属于产学研合作研究中心（I/UCRC）项目。

Pranay Ladiwala | Andreas Kappel | Jayanth Venkatarama Reddy | Melanie Schoelzel | Harnish Mukesh Naik | Johanna Peters | Venkata Gayatri Dhara | Eric M. Young | Maciek R. Antoniewicz | Michael J. Betenbaugh