关于长单链DNA的生产、纯化及应用的研究进展

《Biotechnology Advances》：Research progress in the production, purification, and applications of long single-stranded DNA

　　

• •
  建立了一个整合框架，用于长链单链DNA（long ssDNA）的生产、纯化及其应用。
• •
  比较了生物技术和酶促技术在长链单链DNA生产中的方法，并将其与CRISPR–Cas辅助的加工和转化过程区分开来。
• •
  总结了主要的纯化技术及其在特定应用中的优势。
• •
  强调了长链单链DNA在DNA纳米技术、基因组编辑、生物传感和数据存储中的新兴应用。
• •
  指出了大规模生产长链单链DNA所面临的关键瓶颈及未来发展方向。

引言

长链单链DNA是一类具有重要物理化学性质和多种生物学及技术应用功能的核酸分子。近年来，它已成为DNA纳米技术、基因组工程和合成生物学中的关键分子底物（Hao等人，2020a；Oh和Henderson，2022）。然而，基因组分析和分子生物学工具的进步日益凸显出一种显著更长的单链DNA分子类型，这类分子的长度通常从几千到几十万个核苷酸不等。长链单链DNA在体外条件下极易降解，容易受到核酸酶的切割，通过分子内碱基配对形成二级结构，并且对机械剪切力敏感。单链DNA的特性使其具有高度的结构灵活性和构象自由度，能够形成多种二级和三级结构，如茎环结构和G四聚体（Shen等人，2024）。这些结构高度依赖于特定序列，并且可以受到离子强度和温度等环境因素的调控，为开发响应刺激的核酸材料提供了可能性（Wang等人，2024b）。在生物学上，长链单链DNA自然存在于一些关键生物过程中，例如参与染色体维持的端粒3′突出部分以及某些病毒（如M13噬菌体）的环状单链DNA基因组（Sun等人，2024b；Yang等人，2024b）。同时，这些独特性质也为长链单链DNA的大规模生产、纯化和操作带来了挑战。然而，长链单链DNA具有更高的结构灵活性、更易于进行位点特异性修饰，以及更强的细胞穿透能力，使其在许多前沿应用中具有价值。例如，DNA数据存储利用了DNA分子的高信息密度和长期稳定性，结合来自信息论的纠错算法，为数字数据归档提供了新的机会。此外，长链单链DNA分子还可以作为同源定向基因组编辑的模板（Bennett等人，2021；Ge和Hunter，2019），以及构建DNA折纸纳米结构的支架（Amodio等人，2018；Han等人，2011；Oh和Henderson，2022）。

目前，有几种不同的技术路线用于长链单链DNA的生产和制备，包括基于噬菌体-E. coli的生物生产、模板依赖的酶促扩增和病毒载体辅助的ssDNA基因组生成。相比之下，CRISPR–Cas辅助方法主要作为合成后的处理、序列选择性切割和富集的辅助工具。这些方法在可实现的长度、产率、成本、序列灵活性和操作复杂性方面具有不同的优势和局限性。例如，固相寡核苷酸合成方法对于长链单链DNA合成效率低下且成本高昂，同时错误率较高（Li等人，2024c）。基于噬菌体-E. coli的系统仍然是生产自由长链单链DNA的最成熟生物平台之一，尤其是用于DNA纳米技术的支架DNA。而基于AAV的系统主要生成包装在衣壳中的ssDNA载体基因组，非常适用于基因传递应用；酶促方法，包括非对称PCR和滚环扩增（RCA），虽然提供了更大的序列灵活性，但通常产量较低，更适合实验室规模或中间规模的应用（Nehdi等人，2020）。尽管不断有所改进，所有现有策略仍面临重大的纯化挑战。生物生产平台需要去除宿主来源的杂质，包括基因组DNA和不需要的双链DNA（dsDNA）产物。基于AAV的方法需要纯化病毒颗粒并消除未包装的DNA分子。酶促合成方法常产生截短的产物和反应副产物，需要额外的纯化步骤才能达到足够的纯度（Percze等人，2024）。相比之下，CRISPR–Cas系统不应被视为独立的单链DNA生产平台。它们对长链单链DNA工作流程的主要贡献在于可编程的核酸识别和切割能力，可以支持序列特异性的处理、选择性去除不需要的DNA种类、富集目标产物以及进行分析质量控制。因此，基于CRISPR-Cas的方法更适合作为补充的合成后处理工具，可以与上游的生产或扩增策略相结合使用（Hao等人，2020b）。在自然界中，病毒和细菌已经进化出了利用单链DNA的复杂机制。例如，单链DNA噬菌体利用宿主细胞的机制生成双链复制形式（RF），而M13噬菌体介导的滚环复制已成为最广泛使用的生产长链单链DNA的生物方法之一。在实验室环境中，合成DNA分子是PCR扩增、基于CRISPR的基因组工程、合成生物学和DNA数据存储应用中的关键组成部分（图1）。

然而，在实现高效、经济且可扩展的长链单链DNA合成和纯化方面仍存在重大挑战，这限制了其下游应用的发展。尽管在长链单链DNA生产技术的发展方面取得了显著进展，但目前大多数方法仍主要限于实验室规模的应用。本文综述了长链单链DNA在合成、纯化和应用方面的最新进展（表1）。不同的生产平台在可实现的序列长度、产量、保真度、纯化复杂性和可扩展性方面具有不同的优势和局限性。例如，基于M13的噬菌体系统因能够产生结构稳定的环状单链DNA分子而广泛用于DNA折纸中；然而，生物扩增方法需要宿主细胞培养和后续纯化，这可能会引入与过程一致性和可扩展性相关的挑战（Praetorius等人，2017）。相比之下，酶促DNA合成策略作为一种有前途的替代方案，能够实现可编程和潜在的自动化DNA制造，尽管在合成长度、保真度和成本效益方面仍需进一步改进才能适用于大规模应用（Palluk等人，2018）。

因此，未来长链单链DNA制造平台的发展不仅应考虑生产效率，还应考虑工业要求，包括工艺的稳健性、质量控制、纯化兼容性和法规可行性。对现有生产平台进行全面的比较对于确定不同应用的最佳策略以及加速长链单链DNA技术从学术研究向实际生产的转化至关重要（Carlson，2009；Praetorius等人，2017）。

章节摘录

长链单链DNA的生产和制备策略

单链DNA是DNA纳米技术和基因治疗中的重要组成部分；然而，由于生成长链、高纯度单链DNA分子的困难，大规模生产仍然具有挑战性。噬菌体-E. coli系统利用M13噬菌体介导的滚环复制和E. coli的强健生长特性来实现高产率的单链DNA生产。本节总结了该系统的基本机制，包括辅助噬菌体和辅助质粒的作用

长链单链DNA的纯化技术

长链单链DNA的纯化是分子生物学和生物技术工作流程中的关键步骤。其目标是从含有双链DNA（dsDNA）、RNA、蛋白质、酶、盐和细胞杂质的复杂混合物中分离出完整的目标单链DNA分子，同时去除截短产物、剩余的模板和合成相关的副产物（Damase等人，2017；Zhou等人，2009）。高纯度的单链DNA对于后续应用至关重要，包括适配体筛选、DNA纳米技术和基因表达

长链单链DNA的尖端应用

由于其可编程性、序列特异性和编码复杂结构信息的能力，长链单链DNA已成为新兴纳米技术和生物医学应用中的关键分子成分。在这些应用中，DNA折纸是一个显著的例子，其中长链单链DNA支架能够用于构建精确组织的纳米级结构，用于药物递送、生物传感和分子工程（Lucas等人，2022）。

结论与未来展望

尽管近年来取得了显著进展，但长链单链DNA的制备仍处于从实验室规模发展到工业应用的过渡阶段，整个制造流程中仍面临诸多挑战，包括上游合成、下游纯化、质量控制和法规标准化（Coombes和Dickman，2024；Silva-Santos等人，2022）。到目前为止，没有一种单一策略能够同时满足长度、产量、纯度等方面的所有要求

作者贡献声明

Wang Xiwei、Wu Yuqi：文献搜索、数据分析、概念化、手稿准备。Zhang Xinyu和Du Yingzhen：文献收集、参考文献整理、手稿编辑。Liu Nan和Wang Zengming：手稿修订、科学内容的完善。Zhang Hui：软件资源、资金获取、监督。Gao Xuili和Zheng Aiping：资源协调、资金获取、监督。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（编号2023YFC2605000）、国家自然科学基金（编号82473861）和北京市自然科学基金（编号L248088）的支持。

Xiwei Wang | Yuqi Wu | Xinyu Zhang | Yingzhen Du | Nan Liu | Zengming Wang | Hui Zhang | Xiuli Gao | Aiping Zheng