日粮甜栗单宁制剂与浓度对肉鸡空肠及盲肠微生物区系的差异化调控作用：基于16SrRNA基因测序的研究

《Animals》：Protective Effects of Cinnamaldehyde Against Heat Stress in Mice and Its Regulatory Influence on Estrogen Secretion

　　

甜栗单宁（Sweet chestnut tannins, SCT）被用作家禽的植源性饲料添加剂（phytogenic feed additives），但不同制剂和浓度对肠道微生物群（intestinal microbiota）的影响仍不清楚。研究人员在60只Ross 308肉鸡（每组6只鸡，含未添加对照组）中研究了粉末状、大豆蛋白结合型（soy protein-bound）、微囊化（microencapsulated）和正磷酸结合型（orthophosphoric acid-bound）甜栗单宁在不同日粮浓度下的效应，并采用16S_rRNA基因测序（16S rRNA gene sequencing）对空肠（ileum）和盲肠（caecum）微生物群进行表征。在空肠中，丰富度（richness）、系统发育多样性（phylogenetic diversity）和β多样性（beta diversity）在不同处理间存在差异，而Shannon多样性和均匀度（evenness）保持不变。乳杆菌科（Lactobacillaceae）仍占主导地位，且在多重检验校正（multiple-testing correction）后，未发现与对照组在科（family）或属（genus）水平存在显著差异。在盲肠中，所有α多样性（alpha diversity）和β多样性指标在不同处理间均存在差异，并出现大量处理特异性的分类学变化（taxonomic changes）。多种处理提高了厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidota）比率，而Muribaculaceae在大多数添加组中减少。1000 mg/kg大豆蛋白结合型甜栗单宁增加了副拟杆菌属（Parabacteroides）和 Odoribacter，而1000 mg/kg微囊化甜栗单宁增加了Romboutsia和 Peptostreptococcaceae。Fournierella属在2000 mg/kg大豆蛋白结合型甜栗单宁中增加。这些反应并非始终呈现剂量依赖性（dose-dependent）。这些发现表明，与甜栗单宁相关的微生物变化因肠道区段（intestinal compartment）、制剂和浓度而异，且在盲肠中检测到了更广泛的反应。其对鸟类健康和性能的影响有待进一步研究。

研究背景与意义：家禽肉制品是全球动物蛋白的重要来源，随着其占肉类蛋白比例预计持续上升，维持家禽健康与生产力具有重要意义。抗生素生长促进剂因耐药性问题被限制使用后，研究人员积极探索替代策略，其中植源性饲料添加剂因具有抗菌、抗氧化和免疫调节特性而备受瞩目。单宁作为植物多酚类化合物，传统上被视为抗营养因子，但近期研究表明适宜浓度的特定单宁制剂可改善家禽肠道健康。甜栗来源的可水解单宁已显示出对肉鸡的积极作用并能调节盲肠微生物，但不同制剂和浓度如何影响肠道微生物群结构，尤其是沿消化道不同区段的差异，目前仍缺乏系统认识。空肠作为营养吸收部位微生物多样性较低，盲肠则含有密集的发酵菌群。明确甜栗单宁在不同肠段的作用特点，对优化其日粮应用具有重要科学意义。

研究开展与主要结论：研究人员以60只雌性Ross 308肉鸡为对象，每组6只鸡，随机分为10组，包括1个对照组和9个添加不同制剂（粉末型、大豆蛋白结合型、微囊化型、正磷酸结合型）及浓度甜栗单宁的处理组，进行了为期42天的饲养试验。通过16S_rRNA基因扩增子测序分析空肠和盲肠内容物。结果表明，甜栗单宁对肉鸡肠道微生物群的影响具有显著肠段特异性。空肠中乳杆菌科始终占主导，差异丰度分析校正后未发现与对照组有显著差异的分类单元，提示空肠核心菌群保持稳定。盲肠则表现出高度敏感性，所有α和β多样性指标均存在显著差异，并伴随大量分类学变化。多种处理提高了厚壁菌门相对丰度及厚壁菌门/拟杆菌门（Firmicutes/Bacteroidota, F/B）比率，Muribaculaceae在大多数添加组中显著减少。大豆蛋白结合型1000 mg/kg处理增加了Parabacteroides和Odoribacter，微囊化型1000 mg/kg处理富集了Romboutsia和Peptostreptococcaceae。这些发现说明甜栗单宁诱导的微生物变化因肠道区段、制剂和浓度而异，盲肠反应远强于空肠，且不存在一致的剂量-反应关系。

关键技术方法：本研究在贝尔格莱德畜牧研究所完成，样本队列为60只雌性Ross 308肉鸡，随机分配至10个处理组（每组6只鸡），包括1个不添加甜栗单宁的对照组和9个不同制剂（粉末型、大豆蛋白结合型、微囊化型、正磷酸结合型）及浓度梯度处理组。试验期42天，于第42天屠宰后采集空肠远端及双侧盲肠内容物。采用16S_rRNA基因V3–V4高变区通用引物进行PCR扩增，经Illumina MiSeq平台进行2 × 250 bp双端测序。原始reads导入QIIME 2 v2026.4分析流程，空肠数据使用VSEARCH合并后Deblur去噪，盲肠数据使用DADA2去噪，生成ASV（amplicon sequence variants）特征表，并基于SILVA 138.2数据库进行物种分类。α多样性评估采用Kruskal–Wallis检验，β多样性采用基于Bray–Curtis、Jaccard、weighted和unweighted UniFrac距离的PERMANOVA分析，差异丰度分析采用ANCOM-BC2（Analysis of compositions of microbiomes with bias correction 2）并应用Holm法进行p值校正。

研究结果：

空肠微生物群
测序统计：研究人员从60份空肠样本中获得平均85,307条合并序列，经Deblur去噪和参考匹配后各样本保留15,086至42,234条reads，最终特征表包含1,081个ASV。
α多样性：观测ASV丰富度（H = 20.80，p = 0.0135）和Faith系统发育多样性（H = 20.99，p = 0.0127）组间差异显著，但Shannon多样性（p = 0.2899）和Pielou均匀度（p = 0.5908）无显著变化。经FDR校正后，组间两两比较均无统计学意义。
β多样性：Bray–Curtis（pseudo-F = 5.73，p = 0.001）、Jaccard（pseudo-F = 2.92，p = 0.001）、unweighted UniFrac（pseudo-F = 3.53，p = 0.001）和weighted UniFrac（pseudo-F = 15.70，p = 0.001）分析均表明处理组间群落组成存在显著差异。TP与对照组无显著差异；TSP1000基于Jaccard和unweighted UniFrac、TSP2000基于Bray–Curtis和weighted UniFrac与对照组差异显著。
空肠微生物群的分类组成：门水平上厚壁菌门（85.7%）和变形菌门（12.5%）占主导；科水平上乳杆菌科（84.0%）最优势；属水平上乳杆菌属（61.3%）、Ligilactobacillus（17.8%）和Pseudomonas（12.1%）为主要类群。
空肠微生物群差异丰度分析：科水平Aerococcaceae、Staphylococcaceae、Bacillaceae和Streptococcaceae存在全局变化，但校正后与对照组无显著差异。属水平Ligilactobacillus、Lactococcus、Staphylococcus等全局变化，校正后亦无显著组间差异。

盲肠微生物群
测序统计：盲肠样本平均获得106,550条paired-end reads，经DADA2去噪后保留76.8%–91.0%，最终特征表包含4,639个ASV和4,233,758条非嵌合reads。
α多样性：所有四个α多样性指标均存在显著组间差异，包括观测ASV丰富度（H = 24.64，p = 0.0034）、Shannon多样性（H = 20.94，p = 0.0129）、Faith系统发育多样性（H = 19.60，p = 0.0206）和Pielou均匀度（H = 18.46，p = 0.0302）。
β多样性：四种距离矩阵分析均显示处理组间群落组成存在显著差异（p = 0.001）。所有9个单宁处理组与对照组均存在显著差异，其中TSP1000在Bray–Curtis和weighted UniFrac距离上差异最大，TPA200和TPA250在Jaccard和unweighted UniFrac距离上差异最强。
盲肠微生物群的分类组成：盲肠以厚壁菌门（53.1%）和拟杆菌门（45.0%）为绝对优势门，合计约占98.1%。优势科包括Lachnospiraceae、Barnesiellaceae、Bacteroidaceae、Rikenellaceae等；优势属包括Barnesiella、Bacteroides、Alistipes、Faecalibacterium、Candidatus Vestibaculum、Romboutsia和Butyricicoccus等。
厚壁菌门、拟杆菌门和厚壁菌门/拟杆菌门比率：对照组拟杆菌门（53.60 ± 4.43%）高于厚壁菌门（44.21 ± 4.68%），F/B比率为0.83 ± 0.15。TP、TSP500、TMC2000、TPA250和TPA200显著提高了厚壁菌门相对丰度及F/B比率。
科水平差异丰度分析：35个科存在显著全局变化，其中Tannerellaceae、Muribaculaceae、Bacteroidaceae、Erysipelotrichaceae等效应最强。多数处理组Muribaculaceae丰度显著降低。
属水平差异丰度分析：82个属存在显著全局变化。TSP500、TMC2000和TPA200降低了Bacteroides；TP降低了Barnesiella；TSP1000、TSP500和TPA250降低了Candidatus Vestibaculum。TSP1000和TSP500增加了Parabacteroides，TSP1000增加了Odoribacter，TSP2000增加了Fournierella，TMC1000增加了Romboutsia。

讨论与结论：讨论部分强调，本研究揭示了甜栗单宁对肉鸡肠道微生物群的影响具有显著肠段特异性。空肠主要承担营养消化和吸收功能，其微生物群落受甜栗单宁干预影响相对有限，乳杆菌科主导地位未发生明显改变；盲肠作为微生物发酵的主要场所，其厌氧微生物群落对日粮成分变化表现出高度敏感性。研究观察到Muribaculaceae在几乎所有处理组中均显著减少，提示该科可能是甜栗单宁作用的敏感靶点；特定制剂处理可选择性富集Parabacteroides、Odoribacter、Romboutsia和Fournierella等与碳水化合物发酵和潜在肠道健康相关的菌属。然而，由于本研究未测定微生物代谢产物、宿主生理指标及生长性能，无法从功能层面确定上述菌群变化对鸟类健康或生产性能的实际意义。不完整因子设计限制了对制剂和浓度主效应及交互作用的完全解析。研究结论指出，日粮添加甜栗单宁可在空肠和盲肠诱导差异化的微生物群落重塑，盲肠反应更为显著；其效应依赖于肠道区段、制剂形态及添加浓度，且不存在一致的剂量-反应模式。TSP1000和TMC1000因显著改变潜在有益发酵相关菌群，被视为后续研究微生物代谢、肠道健康和生长性能的候选处理方案。未来需结合多组学技术整合分析，以阐明甜栗单宁调控肠道微生物群的具体机制。