《Animals》：Whole-Genome Characterization of a G3P[59] Rotavirus A Strain from a Diarrheic Donkey Foal Reveals an Unusual Genomic Background
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轮状病毒A（Rotavirus A, RVA）是幼龄动物的重要肠道病原体，而驴源RVA的基因组多样性仍未完全阐明。2025年，研究人员从中国山东省一只腹泻驴驹中分离出一株RVA，编号为RVA/Donkey-wt/CHN/SD2503/2025/G3P[59]（
轮状病毒A（Rotavirus A, RVA）是幼龄动物的重要肠道病原体，而驴源RVA的基因组多样性仍未完全阐明。2025年，研究人员从中国山东省一只腹泻驴驹中分离出一株RVA，编号为RVA/Donkey-wt/CHN/SD2503/2025/G3P[59]（SD2503）。病毒RNA经Illumina NovaSeq双端测序、从头组装（de novo assembly）、基因型分配、序列比对以及基于节段的最大似然系统发育分析（maximum-likelihood phylogenetic analysis）。研究人员成功获取了全部11个基因组节段对应的序列，获得基因型组合G3-P[59]-I3-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6。VP4基因高度分化：BLASTn比对最近似的匹配为P[24]恒河猴株TUCH，核苷酸一致性为79.58%，低于将VP4序列归为同一P基因型所应用的80%阈值。VP4序列随后经轮状病毒分类工作组（Rotavirus Classification Working Group, RCWG）确认为P[59]。其余节段呈现不一致的亲缘关系。VP7与兔源株rab1404以较强的自展支持率（bootstrap support）聚类，而多个内部基因则归属于由猴源、兔源、穿山甲源、马源及其他哺乳动源性RVA所代表的基因型背景。各节段间拓扑结构的不一致性，加之非典型的基因型组合，提示可能存在涉及跨物种相关RVA谱系的历史性重排（reassortment），尽管具体重排事件仍未明确。SD2503为独立鉴定的驴源G3P[59] RVA提供了一个11节段基因组框架，并支持对马科动物RVA开展更广泛的基因组监测。
研究人员对2025年从中国山东省一只2日龄腹泻驴驹中分离的轮状病毒A（Rotavirus A, RVA）毒株SD2503开展了全基因组特征分析。RVA为分节段双股RNA（double-stranded RNA, dsRNA）病毒，是幼龄人类及多种哺乳动物急性胃肠炎的主要病原，其11个基因组节段编码6种结构蛋白（VP1–VP4、VP6、VP7）及5或6种非结构蛋白（NSP1–NSP5/6）。由于基因组分节段特性，遗传背景不同的RVA共感染同一细胞时可发生重排（reassortment），这是驱动病毒多样性与宿主相关进化的关键机制。因此，RVA采用全基因组命名法则，按Gx-P[x]-Ix-Rx-Cx-Mx-Ax-Nx-Tx-Ex-Hx顺序分配基因型，分别对应VP7、VP4、VP6、VP1、VP2、VP3及NSP1–NSP5；其中VP4采用80%核苷酸一致性阈值进行同一P基因型归属。马科动物RVA是幼驹腹泻的重要病因，G3P[12]与G14P[12]占全球已表征马源株主体，但非典型马RVA证据表明马科动物亦可获得与其他哺乳动物相关的病毒或基因组节段。驴源RVA信息尤为有限：2019年山东省暴发的驴驹严重肠炎与RVA/Donkey-wt/CHN/Don01/2019/G3P[12]相关，其VP7与蝙蝠相关G3病毒相关而VP4为马样P[12]；2021年HB01/China/2021/G3P[12]的VP7亦位于非典型G3谱系附近。2025年河北鉴定的HB2503为另一株G3P[59]驴RVA，但缺乏公开核苷酸序列。在此背景下，对SD2503开展全基因组表征可为理解该非典型P基因型在马科动物中的多样性提供基因组参考，并凸显无法通过VP7和VP4分型单独充分理解的非典型病毒监测需求。
研究人员采用的关键技术方法包括：从山东省单只腹泻驴驹非侵入式采集粪便样本，经磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）悬液离心、0.22 μm滤膜过滤后，以含结晶胰蛋白酶的DMEM于37°C激活并接种Madin-Darby牛肾（Madin-Darby bovine kidney, MDBK）细胞，经连续盲传至第四代出现细胞病变效应（cytopathic effects, CPE）；各代培养物经VP6靶向一步法逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）检测，并由透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）负染观察证实。病毒RNA经TRIzol提取后，使用Illumina NovaSeq 6000平台行150 bp双端测序。原始读段经fastp过滤、接头修剪，采用SPAdes与SOAPdenovo进行从头组装（de novo assembly）。11个RVA基因组节段通过Prokka与Prodigal注释并与参考序列人工比对；基因型依轮状病毒分类工作组（Rotavirus Classification Working Group, RCWG）全基因组分类框架分配，VP4序列提交RCWG确认；读段回贴采用BWA-MEM与SAMtools评估覆盖度。序列比对采用MAFFT v7，最大似然系统发育树在MEGA12中构建，自展重复1000次。
研究结果显示：
3.1 SD2503的分离与形态学鉴定
研究人员将处理后的粪便材料接种于MDBK细胞并连续盲传，第四代观察到细胞质空泡化、皱缩及从细胞单层脱落的细胞病变效应。各代培养物经VP6靶向RT-PCR均检出RVA RNA，透射电镜负染观察显示轮状病毒样颗粒具有特征性轮状形态，据此分离获得该病毒并命名为SD2503。
3.2 测序输出与基因组结构
经质量过滤后保留12.68百万条读段，Q20和Q30比率分别为97.20%和93.51%。成功回收全部11个RVA基因组节段，组装序列长度从711 nt（NSP5）到3280 nt（VP1），预测蛋白从159个氨基酸（NSP4）到1081个氨基酸（VP1）。SD2503被分配为基因型组合G3-P[59]-I3-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6。读段回贴分析显示平均测序深度从VP3的93.18×到NSP3的2652.05×，10个节段在≥1×深度覆盖率达100.00%，NSP2覆盖率为95.29%，为全部11个基因组节段的回收提供了定量读段支持。
3.3 VP4高度分化及P[59]确认
VP4是SD2503中分化最显著的节段，BLASTn最近似匹配为P[24]恒河猴株TUCH，在2346 nt比对区域中核苷酸一致性为79.582%，低于80%阈值。VP4序列经RCWG审核确认为P[59]。在包含已确认P基因型代表株的广义VP4最大似然树中，SD2503形成独立分支，未聚于常规马P[12]组内，尽管其系统发育位置似乎更接近驼相关P[40]参考株。
3.4 VP7系统发育分析将其置于非典型G3谱系
VP7节段被归为G3型，但未与主要常规马G3P[12]簇聚类。相反，SD2503与兔源株rab1404形成姐妹关系，自展支持率为96%，这与BLASTn结果一致（rab1404为最近似VP7匹配，核苷酸一致性95.45%）。驴株Don01/2019和HB01/2021则与其他非典型G3及蝙蝠相关G3病毒聚类，凸显了马科动物中检出的G3 VP7谱系的多样性。
3.5 内部基因系统发育揭示拓扑结构不一致
9个内部基因树显示SD2503未遵循单一宿主相关系统发育模式。VP1（R3）与兔源株N5以98%自展支持率形成姐妹关系，并处于含穿山甲相关R3参考株的更大谱系中；VP2（C3）与rab1404以83%自展支持率形成姐妹关系；VP3（M3）与rab1404以100%自展支持率聚类；VP6归为I3，不同于I1、I2、I6和I17参考组；NSP1（A9）落入含兔源和恒河猴样病毒的A9群；NSP2（N3）与穿山甲相关N3序列聚类；NSP3（T3）嵌入含猴、兔、马及穿山甲相关病毒的广义T3谱系；NSP4被置于E3，不同于常规马株03V04954的E2簇；NSP5（H6）靠近恒河猴/猴样H6病毒。这些节段特异性聚类彼此之间以及与常规马G3P[12]基因组背景均不一致。
3.6 基因型组合提示独特的马科动物RVA背景
SD2503的完整基因型组合为G3-P[59]-I3-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6，与常见的马G3P[12]组合（G3-P[12]-I6-R2-C2-M3-A10-N2-T3-E2-H7）显著不同。在基因型水平上，SD2503与非典型马株E3198（G3-P[3]-I3-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6）在除VP4外的10个基因组节段上基因型分配完全相同，但个体系统发育树并未将每个节段一致地置于E3198或任何其他单一参考株附近。因此，该基因组最好被解释为属于更广泛的跨物种相关RVA基因库，而非某一先前采样病毒的直接衍生物。
讨论与结论部分指出，SD2503的VP4属于新确认的P[59]基因型，与已确立P基因型差异显著；9个内部节段具有非典型基因型组合，不同于常与马G3P[12]病毒相关的内部基因背景。11个节段树拓扑结构不一致，将SD2503与不同跨物种相关RVA谱系联系起来，这些特征共同表明该病毒具有非典型基因组背景，符合涉及跨物种相关RVA谱系的可能历史重排，但具体进化事件仍未解决。VP4的发现之所以重要，是因为当监测局限于常见马G/P组合时，P基因型多样性可能被遗漏；SD2503 VP4与P[24] TUCH之间79.58%的一致性低于全基因组分类框架中确立的80%同一基因型截断值。在广义VP4树中，SD2503保持独立于马P[12]病毒和P[24]参考簇，但该树未用于重新定义基因型，因为正式P[59分配依据RCWG确认；相反，它为该序列的高度分化提供了进化背景。VP7树增加了第二个非典型特征，SD2503与兔源株rab1404以96%自展支持率聚类。rab1404本身具有mosaic G3-P[22]-I2-R3-C3-M3-A9-N2-T3-E3-H3基因组，被解释为涉及动物RVA谱系多次重排事件产物；这种关系不应被解读为兔直接传播病毒给驴，而是表明密切相关的G3基因已在更广泛的哺乳动物RVA网络中循环，该网络还包括蝙蝠、猴、猫/狗及马相关病毒。内部基因分析强化了这一解释，SD2503多个节段占据由猴RRV样、兔、穿山甲相关或非典型马病毒代表的基因型组，而VP6为I3，不同于常规马G3P[12]株的I6背景。整体基因型组合尤其值得关注，因为其在10个基因型位置上与E3198相同，而E3198与印度蝙蝠相关马G3P[3]株均说明马科动物可携带并非典型马G3P[12]/G14P[12]群组成部分组装的RVA基因组；然而，基因型同一性并不确立直接祖先关系。研究人员强调，RVA进化中重排与跨物种传播已有充分记录，SD2503符合这一更广泛的进化模式，但现有数据未确立重排事件的数量、时间、方向或亲代病毒，识别特定亲代病毒或传播来源需要更密集的同期采样及相关动物宿主的更多完整基因组。
关于研究局限性，研究人员指出仅表征了单一临床病例，其检出并不确立与腹泻的因果关系；参考序列在宿主物种和地理区域间分布不均，系统发育关系不能确立直接跨物种传播或识别供体宿主；5
′和3
′基因组末端未独立验证，且NSP2存在不完全覆盖。综上所述，SD2503为独立鉴定的驴RVA，其基因型组合为G3-P[59]-I3-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6，揭示了非典型基因组背景及可能的基因组重排。潜在重排事件的数量、时间、方向和亲代谱系无法从现有数据中确定。研究人员认为，需要在驴、马、野生动物及其他共生哺乳动物中开展更广泛的基因组与流行病学监测，结合额外临床调查，以确定P[59] RVA株的流行率、宿主分布、临床意义及进化历史。
