《Separations》：Quality Standardization and Chemical Consistency Assessment of Chijasi-tang (Zhizichi Decoction) via Simultaneous Determination of Five Marker Compounds and Chemical Fingerprinting by UPLC-PDA
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栀子豉汤（Chijasi-tang，中文名知子豉汤）为经典两味药方，用于神经精神症状，由富含环烯醚萜类的果实与发酵蒸制大豆制品组成，目前尚无覆盖两味药材指标成分的经验证的单次进样测定方法，亦缺乏商品原料药变异性数据。研究选取格尼泊苷（geniposide，源于
栀子豉汤（Chijasi-tang，中文名知子豉汤）为经典两味药方，用于神经精神症状，由富含环烯醚萜类的果实与发酵蒸制大豆制品组成，目前尚无覆盖两味药材指标成分的经验证的单次进样测定方法，亦缺乏商品原料药变异性数据。研究选取格尼泊苷（geniposide，源于Gardenia jasminoides）与四种异黄酮（daidzin、genistin、daidzein、genistein，源于发酵Glycine max）作为指标成分，并经Q-TOF MS与紫外光谱鉴定。采用HSS C18色谱柱（1.8 μm，2.1 × 100 mm）的UPLC-PDA方法（254 nm）在12 min内分离五种对照品（相邻指标成分分离度≥12.37；总运行时间25 min），并依据ICH Q2(R2)进行方法验证；在提取物中，最接近的指标成分-基质峰对为daidzin与相邻基质峰（保留时间差0.17 min）。对六批商品原料药进行分析，并以指标成分含量与14峰指纹图谱表征水、30%乙醇及70%乙醇提取物（每个栀子果实批次一种溶剂；每种溶剂三份）。该方法r2 ≥ 0.9995，平均加标回收率85.54–109.30%，日内与日间精密度RSD ≤ 4.18%，供试品溶液稳定性达156 h。一批韩国栀子果实中格尼泊苷含量为2.40%，低于韩国药典限度（≥ 3.0%）；一批中国淡豆豉中未检出异黄酮。针对每种溶剂提出暂定指标成分限度。同一溶剂体系内指纹图谱相关系数r ≥ 0.954，但未反映批次间格尼泊苷含量差异。该方法适用于栀子豉汤的常规质量控制，结果表明原料药合格性评价、基于指纹图谱的鉴别试验与指标成分定量测定应结合使用。这些探索性、实验室规模数据可为栀子豉汤制剂的未来CMC开发提供参考。
研究背景：栀子豉汤（中文名知子豉汤）由Gardenia jasminoides（G. jasminoides）与发酵Glycine max（G. max）组成，首载于汉代《伤寒杂病论》（Shanghan Zabing Lun），后在《东医宝鉴》（Donguibogam）中广泛用于烦躁、严重失眠及抑郁情绪，现代临床用于慢性应激所致自主神经功能紊乱、重性抑郁障碍、广泛性焦虑障碍及睡眠障碍等神经精神疾病。将传统多味复方转化为标准化现代药品，需以化学、生产与控制（CMC）框架保障从原料药到成品的批间理化一致性。多味药基质因产地、环境、采收季节及采后加工或发酵而呈现显著定性与定量差异，监管机构推荐"指标成分定量测定＋色谱或光谱化学指纹图谱"的双层质量控制策略。既往研究存在不足：Guo等（2023）以液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）研究配伍机制，属机制表征而非常规质量控制；其使用实验室自制样品，未涉及商品原料药变异性；且缺乏按ICH Q2(R2)验证的定量方法。分析层面，栀子豉汤单次质控面临三个问题：指标成分极性跨度大（高极性环烯醚萜苷至疏水苷元）；含量相差可达两个数量级（格尼泊苷约1.5–4.7%，单个异黄酮0.01–0.48%）；发酵大豆基质中异黄酮共轭物等共提成分与异黄酮苷处于同一保留窗口，存在指标成分-基质共洗脱风险。既往方法分别针对单味药（HPLC-DAD-ESI-MS测栀子环烯醚萜、反相HPLC测大豆异黄酮），运行时间常达45–70 min，且未检验常用指纹图谱相似度标准（r ≥ 0.95）能否检出单个指标成分的定量缺陷。
研究目的与内容：本研究设四项目标：（1）按ICH Q2(R2)开发并验证单次进样UPLC-PDA方法，同时测定格尼泊苷与四种异黄酮，经Q-TOF MS与紫外光谱确证，并分别评价对照品间及提取物中指标成分与相邻基质峰间的分离度；（2）将方法应用于两味药商品原料药，评价其药典符合性；（3）表征水、30%乙醇与70%乙醇提取物并提出暂定指标成分限度；（4）评价14峰指纹图谱作为鉴别与一致性试验，并实验检验指纹图谱相似度能否替代指标成分定量。
关键技术方法（不超过250字）：采用Waters Acquity UPLC系统配光二极管阵列（PDA）检测器，HSS C18柱（1.8 μm，2.1 × 100 mm，30 °C），流动相为0.1%甲酸水/乙腈（99:1）与0.1%甲酸乙腈，线性梯度，流速0.25 mL/min，进样2.0 μL，254 nm检测（栀子原料药格尼泊苷于240 nm测定）。以Q-TOF Premier质谱仪（电喷雾电离，正离子模式）鉴定五种指标成分。方法按ICH Q2(R2)与韩国食品医药品安全处（MFDS）验证规范评价系统适用性、专属性、线性、检测限与定量限、加标回收率、精密度、溶液稳定性与耐用性。指纹图谱以格尼泊苷为内参峰，计算14个特征峰的相对保留时间（RRT）与相对峰面积（RPA），以Pearson相关系数评价相似度。样本来源：栀子果实三批（韩国莞岛栽培品、中国河南野生品与栽培品各一批），发酵大豆三批（韩国庆北发酵大豆、中国河南淡豆豉、韩国清麴酱丸），各来源仅一批。
研究结果：
3.1 指标成分结构鉴定与原料药质量评价：经准确质量、碎片离子与紫外吸收最大波长（λmax）与对照品比对确证五种指标成分，格尼泊苷可见m/z 411.1367 [M + Na]+、m/z 227.0984苷元离子及m/z 209.0874脱水离子（基峰），λmax为240 nm；四种异黄酮分别为daidzin（m/z 417.1180 [M + H]+，249 nm）、genistin（m/z 433.1128，260 nm）、daidzein（m/z 255.0652，250 nm）、genistein（m/z 271.0601，260 nm）。原料药评价显示批间差异：韩国莞岛栀子（Gardenia #1）格尼泊苷2.40%，低于韩国药典（KP）限度（≥ 3.0%）；中国河南野生品（3.35%）与栽培品（4.47%）符合规定。发酵大豆中，韩国庆北品四种异黄酮均可定量（daidzin 0.029%、genistin 0.063%、daidzein 0.029%、genistein 0.034%），清麴酱丸亦可检出（0.040%、0.048%、0.008%、0.003%），而中国河南淡豆豉（Glycine #2）四种异黄酮均未检出（N.D.），254 nm及其他波长下均无大豆来源峰；因同法可定量另两批，方法特异性失效可能性低，但该基质回收率未测，提取或基质效应不能完全排除，可能原因为加工中热降解或浸出，或原料非正宗发酵大豆，本研究无法区分。
3.2 UPLC-PDA同时测定方法验证：五种指标成分在12 min内分离（总运行时间25 min），保留时间依次为格尼泊苷5.96 min、daidzin 6.55 min、genistin 7.82 min、daidzein 10.05 min、genistein 11.95 min；空白无干扰。系统适用性中理论板数均>2000，拖尾因子0.98–1.10，对照品间分离度12.37–35.26，峰面积系统精密度RSD 0.54–0.91%。提取物中指标成分-基质分离以保留时间差评价：格尼泊苷、genistin、daidzein、genistein与最近基质峰ΔtR ≥ 0.40 min，daidzin与Peak 5最近（0.17 min），两峰分别积分且面积重现（RSD 0.44%与1.10%），daidzin回收率100.8–105.4%，定量可接受，但该关键峰对分离度未数值化，常规使用前应测定并纳入系统适用性。五种成分线性良好（r2 ≥ 0.9995），检测限与定量限分别为0.0058–0.022 μg/mL与0.019–0.074 μg/mL。三个加标水平平均回收率85.54–109.30%（RSD ≤ 2.12%），最低为daidzein 50%水平（85.54% ± 1.82%）；日内精密度RSD 0.65–1.88%，日间（三日）1.67–4.18%。溶液稳定性试验中五种成分峰面积156 h内RSD 0.20–1.98%，30%乙醇提取物供试液至少稳定83 h（偏差±3.2%内），156 h时genistin峰面积增加5.2%略超±5%，故供试液应在制备后83 h内分析。耐用性试验（流速±0.02 mL/min、柱温±2 °C、甲酸±0.01%）中保留时间RSD 0.12–0.85%，相邻指标成分分离度≥1.8，回收率98.4–101.5%。基质效应未单独评价，但30%乙醇提取物加标回收率符合标准，提示该提取物中基质效应未影响定量；水与70%乙醇提取物基质效应未评估，常规应用前应确认。
3.3 各提取溶剂指标成分含量与限度：随乙醇比例升高，异黄酮苷元含量增加，daidzein由水提0.03%升至30%乙醇0.07%、70%乙醇0.17%，genistein由0.02%升至0.04%、0.17%；格尼泊苷在70%乙醇提取物中最高（3.97%），30%乙醇中最低（2.03%）。提取物收率随乙醇浓度升高而下降（水9.0 ± 0.1% > 30%乙醇8.2 ± 0.1% > 70%乙醇7.1 ± 0.1%）。以各溶剂三份提取物均值90%计算下限时，多份提取物低于该基准（Lot 3的30%与70%乙醇提取物格尼泊苷1.51%与2.81%，其70%乙醇提取物daidzein与genistein 0.11%与0.07%，Lot 1水提物genistein 0.01%），故改以最小值提出暂定下限：水提物（格尼泊苷≥2.80%、daidzin≥0.10%、genistin≥0.14%、daidzein≥0.025%、genistein≥0.010%）；30%乙醇（≥1.45%、≥0.13%、≥0.22%、≥0.055%、≥0.035%）；70%乙醇（≥2.70%、≥0.24%、≥0.40%、≥0.10%、≥0.065%）。由低含量Gardenia #1制备的提取物亦符合两套限度，说明仅凭提取物限度无法检出不合格原料药，药典原料药测定仍为关键控制点。
3.4 14峰指纹图谱方法验证：14个特征峰（Peak 1–9及五种指标成分）在各批提取物中稳定分离，紫外λmax分别为Peak 1（272 nm）、Peak 2（236 nm）、Peak 3（238 nm）、Peak 4（240 nm）、格尼泊苷（240 nm）、daidzin（249 nm）、Peak 5（260 nm）、genistin（260 nm）、Peak 6（250 nm）、Peak 7（220 nm）、Peak 8（229 nm）、Peak 9（260 nm）、daidzein（250 nm）、genistein（260 nm）；Peaks 2–4与栀子环烯醚萜苷一致，Peaks 5、6、9与大豆异黄酮共轭物一致，Peak 1归为发酵大豆，Peaks 7、8无法归属单一药材；Peaks 1–9未作结构鉴定。水提物重复进样（n = 6）精密度：保留时间（RT）RSD 0.01–0.04%、RRT 0.01–0.04%、峰面积（PA）0.18–1.91%、RPA 0.27–1.91%；三日日间精密度RT 0.08–0.14%、RRT 0.01–0.18%、PA 0.22–3.53%、RPA 0.10–3.70%，均在≤5.0%标准内；九份提取物中14峰均检出并积分。
3.5 批间化学一致性与相似度评价：以各溶剂三份提取物的均值与中位数参考谱比较，所有提取物均超过r ≥ 0.95（水提物0.997–1.000，30%乙醇0.981–0.998，70%乙醇0.954–0.999）；Gardenia #1制备的各溶剂提取物r ≥ 0.998；Lot 3的30%乙醇提取物格尼泊苷1.51%（低于溶剂均值26%且低于均值90%基准）仍显示r = 0.981–0.989。因原始峰面积以格尼泊苷峰为主，Pearson相关主要反映整体图谱一致性，对单个指标成分的定量偏差相对不敏感；RPA归一化相似度与余弦相似度分别为0.932–0.985与0.935–0.985。结果表明指纹图谱相似度补充但不能替代指标成分定量测定，支持双层质量控制策略。
讨论部分总结：检测技术选择上，PDA因五种指标成分具强紫外发色团且浓度远高于定量限、为相关药典方法所用、成本较低且可提供峰纯度信息而被选用，质谱仅用于指标成分确证。色谱方面，HSS C18柱配合流动相A中含1%乙腈可降低相去湿（"相塌陷"）风险，使格尼泊苷远离死体积且保留重现；0.1%甲酸（pH约2.7）使异黄酮酚羟基保持中性并抑制硅醇基解离，减少次级离子交换作用，峰形对称。原料药化学异质性方面，格尼泊苷含量差异与文献报道的市场波动（1.20–7.17%）一致，但每来源仅一批，结果不能推广至整个来源；淡豆豉传统工艺为桑叶与青蒿煎液浸泡大豆后固态发酵并反复蒸制，异黄酮缺失可能源于热降解或浸出，亦不能排除误用或替代。溶剂依赖性方面，70%乙醇提取物单位质量中五种指标成分含量最高，但仅反映化学组成，不代表药理优越性；韩国MFDS法规对收载于公认古籍、采用传统水或低乙醇提取工艺的传统 herbal 处方可减免毒理与临床资料要求，可能有利于水或30%乙醇提取物路径。指纹图谱方面，因格尼泊苷占总峰面积29–52%，原始峰面积相关对单个指标成分偏差不敏感，高相关系数不能揭示次要药味的遗漏或替代，故鉴别标准（14个特征峰均在RRT窗口内）对真实性更具信息价值；参考谱由同一批提取物构建，仅为内部一致性，申报需建立独立参考提取物。局限性包括：Peaks 1–9未结构鉴定；提取工艺与分析样品制备未系统优化；每来源仅一批、每栀子批次每溶剂仅一次煎煮制备；指纹图谱参考谱源于被评价样品本身；未评价药理活性、安全性、生物利用度与临床有效性；仅证明供试液稳定性，提取物与成品稳定性需按ICH Q1A(R2)建立。据此提出分步质量评价策略：原料药合格性（栀子按KP限度测格尼泊苷，发酵大豆测四种异黄酮存在与含量，无检出者拒收）；提取物鉴别（14峰均在RRT窗口内）；提取物一致性（与参考谱r ≥ 0.95）；提取物含量测定（按溶剂专属暂定限度），四项均满足方可放行。
研究结论翻译：本研究开发并依据ICH Q2(R2)验证了用于栀子豉汤质量控制的单次进样UPLC-PDA方法。采用亚2 μm HSS C18柱，五种极性不同的指标成分——源于G. jasminoides的格尼泊苷与源于发酵G. max的四种异黄酮（daidzin、genistin、daidzein、genistein）——作为对照品在12 min内分离（总运行时间25 min），并在提取物中实现与相邻基质峰的分离后定量，所用紫外检测在生产企业实验室广泛可及。商品原料药中，一批栀子果实不符合药典格尼泊苷要求（2.40% vs ≥3.0%），一批淡豆豉未检出异黄酮，凸显以经验证定量方法进行原料药合格性评价的必要性。70%乙醇提取所得单位质量提取物的指标成分含量最高，此仅反映化学组成，不意味着药理优越性。针对每种溶剂提出暂定限度，14峰指纹图谱显示溶剂内高度一致性（r ≥ 0.954），但指纹图谱相似度本身未反映单个指标成分的定量差异。因此，原料药合格性评价、基于指纹图谱的鉴别试验与指标成分定量测定应结合使用。这些探索性、实验室规模发现可为栀子豉汤植物药物质及标准化草药制剂的未来CMC开发提供参考。
