循环miR-26b-5p作为活动性肺结核潜在宿主源性生物标志物的多数据集交叉验证与诊断价值评估

《Infection and Drug Resistance》：Circulating miR-26b-5p as a Potential Host-Derived Biomarker for Active Pulmonary Tuberculosis

背景：结核病（tuberculosis, TB）至今仍是全球重大传染病，亟需新型宿主源性生物标志物以改善诊断。循环微小RNA（microRNA, miRNA）因具备稳定性及免疫调节功能而成为有前景的生物标志物；然而，经临床验证的TB相关miRNAs仍然有限。本研究旨在鉴定与活动性肺结核（active pulmonary TB）相关的循环miRNAs。

方法：本研究纳入90名参与者：活动性肺结核（n=30）、临床治愈TB（n=30）及健康对照（n=30）。候选miRNAs通过血浆miRNA谱分析进行筛查，并进一步利用3个公开可获得的miRNA数据集加以验证。循环miR-26b-5p通过逆转录定量聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）进行定量。采用logistic回归评估其与活动性TB状态的关联，并通过受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析评价其判别性能。通过生物信息学分析探索miR-26b-5p的假定靶基因及富集通路。

结果：微阵列筛查鉴定出108个候选miRNAs，跨数据集分析确定miR-26b-5p为唯一具有一致下调表达的重叠候选。循环miR-26b-5p在活动性TB患者中水平降低，在临床治愈组中水平升高。在校正BMI与PLR后，其仍与活动性TB状态保持关联。miR-26b-5p的曲线下面积（area under the curve, AUC）为0.867，而联合模型的AUC达到0.956。生物信息学分析鉴定出74个假定基因，其中EP300、GSK3B与PTEN为网络枢纽基因，PI3K-Akt为富集通路之一。

结论：循环miR-26b-5p与活动性肺结核相关，并显示出初步的判别价值，支持其作为候选宿主反应标志物接受进一步评估。

**研究背景**

结核病（tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起，至今仍是全球重大公共卫生挑战。尽管微生物学与分子诊断技术已显著提升，常规临床实践中活动性肺结核的早期识别仍然困难：痰涂片镜检敏感性有限，尤其在低细菌载量患者中表现不佳；分枝杆菌培养周期冗长；快速分子检测虽敏感性较高，却仍依赖呼吸道标本的可获得性与质量。因此，关键临床缺口不仅在于检测M. tuberculosis感染本身，更在于从潜伏结核感染、临床治愈TB及非结核炎症或肺部疾病中快速、非痰液鉴别活动性肺结核；临床上有用的生物标志物必须能区分活动性TB与相关非TB对照，而非仅与健康人群相区分。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一类内源性非编码小分子RNA，可在转录后水平通过促进信使RNA降解或抑制翻译调控基因表达，参与炎症、免疫细胞分化、凋亡、自噬及代谢适应，因而循环miRNA作为反映宿主对M. tuberculosis感染反应的非痰液候选标志物具有吸引力。然而，既往研究报道的个体miRNA签名在不同人群、样本类型与实验平台间存在异质性，且很少在纳入相关非TB对照的特征良好临床队列中经独立验证。miR-26b-5p作为miR-26家族保守成员，已被提示参与细胞增殖、凋亡、炎症及免疫应答调节；但其在活动性肺TB患者循环中的表达是否改变、临床治愈个体中是否不同、以及能否提供常规炎症指标之外的诊断信息，均尚未明确。

**研究人员开展的研究**

研究人员围绕三个目标开展研究：其一，确定循环miR-26b-5p在活动性TB、临床治愈TB及非TB对照中的表达模式；其二，评估其识别活动性肺TB的潜在价值及其与临床特征、全身炎症指标的关联；其三，探索miR-26b-5p失调在TB相关宿主反应中的生物学相关性。研究得出汇聚性证据：循环miR-26b-5p在活动性肺结核中表达降低、在临床治愈个体中升高，并在多个独立M. tuberculosis相关数据集中呈现一致下调；其具备初步判别活性，与BMI及PLR联合可进一步提升表观判别性能，凸显其作为未来非痰液宿主反应生物标志物策略的候选潜力。

**主要关键技术方法**

本研究为探索性病例对照研究，纳入90名参与者（活动性肺TB、临床治愈TB各30例及健康对照30名），队列来源于中国湖南张家界市人民医院感染科2024年1月至12月招募人群。关键技术方法包括：（1）血浆miRNA微阵列分析，每组5名参与者血浆等体积混合，以Benjamini-Hochberg校正P<0.05、|log₂FC|≥1且归一化信号强度≥50为筛选阈值，组间取交集获得108个候选miRNAs；（2）GEO2R跨数据集验证，分析GSE25435、GSE49951与GSE70425三个公开数据集；（3）RT-qPCR验证，采用茎环逆转录策略，miR-16-5p与miR-93-5p为双内参，2^-ΔΔC_t法计算相对表达量；（4）生物信息学分析，整合miRDB、TargetScanHuman 8.0与GeneCards预测靶基因，STRING 12.0构建蛋白质相互作用网络并经cytoHubba鉴定枢纽基因，clusterProfiler完成GO/KEGG富集分析；（5）统计分析采用SPSS 26.0，行logistic回归、ROC曲线分析及2000次bootstrap内部验证。

**研究结果**

*外周血RNA质量评估与差异表达miRNAs的微阵列鉴定*
RNA质量评估显示三组OD_260/280为1.80–1.86、OD_260/230为2.02–2.11，28S与18S rRNA条带清晰，符合芯片分析要求。微阵列分析经预处理保留1199个miRNAs，三组两两比较取交集：活动性TB高于健康对照且治愈TB低于活动性TB者46个、反之62个，共获得108个候选miRNAs。

*跨数据集评估鉴定miR-26b-5p在M. tuberculosis相关数据集中的一致表达模式*
三个GEO数据集中达差异表达标准的miRNAs分别为123、54、644个，三集方向一致者7个；与108个候选miRNAs取交集，hsa-miR-26b/miR-26b-5p为唯一重叠候选。miR-26b-5p在三个数据集中均下调（GEO2R logFC分别为-0.6305、-1.17、-0.3454，P=0.0200、0.0159、0.0013）。鉴于三集生物学背景不同（PBMC临床比较、树突状细胞实验感染模型、细胞特异性图谱），该结果被视为表达方向一致性的跨数据集证据。

*miR-26b-5p表达谱与潜在调控网络分析*
miR-26b-5p广泛存在于血浆外泌体、血浆微粒、尿液微粒、唾液外泌体及乳汁外泌体等细胞外囊泡来源，并在甲状腺、表皮及肺组织等可检测到表达。整合miRDB、TargetScanHuman 8.0与GeneCards预测，获得74个假定miR-26b-5p/TB相关基因；GO富集提示主要参与炎症反应调控、免疫细胞活化、细胞增殖及凋亡；KEGG分析显示PI3K-Akt信号通路富集最强；STRING网络中以EP300、GSK3B、PTEN连接度最高。

*外周血miR-26b-5p表达验证及其诊断性能评估*
RT-qPCR显示三组相对表达量差异显著（F(2,87)=21.675，P<0.001）：健康对照1.249±0.734、活动性TB组0.367±0.375、临床治愈组0.843±0.599。活动性TB组显著低于健康对照（校正P<0.001），临床治愈组显著高于活动性TB组（校正P<0.001），但与对照组差异未达统计学意义（校正P=0.094）；因治愈组为独立横断面比较而非配对纵向样本，其较高水平被解读为组间差异而非治疗恢复证据。单变量logistic回归显示miR-26b-5p与活动性TB状态负相关（OR=0.060，95% CI 0.014–0.254，P<0.001）；多变量模型中OR=0.028（95% CI 0.003–0.300，P=0.003）。单独miR-26b-5p表观AUC为0.867（95% CI 0.777–0.956），扩展模型（BMI+PLR+miR-26b-5p）AUC达0.956（95% CI 0.907–1.000），似然比检验显著（χ²=12.330，P<0.001）；表观最优阈值0.670下灵敏度83.33%、特异度100.00%、准确率91.67%，2000次bootstrap校正后乐观校正AUC分别为0.896与0.944。

*与外周血miR-26b-5p表达相关的临床因素*
活动性TB组女性患者miR-26b-5p低于男性（P=0.003）；总体队列中miR-26b-5p与BMI<18.5者低于BMI≥25 kg/m²者（P=0.05，边缘性）、MLR≥0.3者低于MLR<0.3者（P=0.02）、PLR≥180者低于PLR<180者（P=0.02）。经Benjamini-Hochberg校正后，miR-26b-5p与BMI正相关（ρ=0.335，校正P=0.007）、与PLR负相关（ρ=-0.303，校正P=0.011），与年龄、MLR、SIRI无显著关联。

**讨论部分**

讨论指出，本研究在活动性肺TB患者中观察到循环miR-26b-5p的特异性降低，且与初始血浆miRNA筛查及三个独立M. tuberculosis相关数据集的方向一致。三集虽生物学异质，但miR-26b-5p变化方向保持一致；既往实验研究提示miR-26b可调控M. tuberculosis感染THP-1细胞中TAK1/NF-κB相关免疫反应，为从宿主反应角度研究miR-26b-5p提供生物学合理性。活动性TB伴随BMI降低及MLR、SIRI、PLR升高，符合营养紊乱与全身炎症相互作用的认识，miR-26b-5p部分反映这种免疫代谢环境；联合模型表观判别性能优于单独指标，支持分子宿主反应标志物与常规临床炎症参数互补的多标志物策略。作者同时承认局限性：单中心、样本量小、治愈组为横断面而非纵向配对、发现阶段使用混合血浆样本、靶基因与通路分析为计算性结果；未来需在纳入潜伏结核感染及临床相关非TB肺疾病的更大、多中心队列中验证，以确立疾病特异性、可重复性及潜在诊断价值。

**研究结论部分翻译**

本研究提供汇聚性证据，表明循环miR-26b-5p与活动性肺TB相关，并反映疾病相关的宿主反应改变。其在活动性TB中表达降低、在临床治愈个体中水平升高，并在跨独立M. tuberculosis相关数据集中呈现一致下调，支持其生物学与临床相关性。结合其初步判别性能及与常规临床指标的互补价值，这些发现凸显miR-26b-5p作为未来非痰液宿主反应生物标志物策略的候选潜力。需要在更大规模的多中心队列（纳入潜伏结核感染及临床相关非TB肺疾病）中进一步验证，以确立其疾病特异性、可重复性及潜在诊断价值。