TRIM11通过N-WASP/ARP2/3通路调控结直肠癌中的伪足形成和细胞骨架重塑

《Chemico-Biological Interactions》：TRIM11 Regulates Filopodia Formation and Cytoskeletal Remodeling Through the N-WASP/ARP2/3 Pathway in Colorectal Cancer

　　

摘要

丝状伪足是质膜的细长延伸部分，富含肌动蛋白，这有助于癌细胞的迁移和侵袭行为。TRIM11（三联基序11）是一种E3泛素连接酶，在结直肠癌（CRC）的进展和晚期阶段起着重要作用；然而，其在细胞骨架重塑中的作用尚未得到充分证实。本研究通过生物学信息学、分子对接和功能分析探讨了TRIM11在调控CRC细胞中丝状伪足形成和转移行为中的作用。使用靶向TRIM11的siRNA在CRC（HCT116）细胞中敲低TRIM11，并通过Western Blot分析进行了验证。敲低TRIM11后，CRC细胞的迁移和侵袭能力显著减弱，这一点通过Transwell侵袭实验和Scratch伤口愈合实验得到了证实。此外，TRIM11敲低还促进了与自噬相关的标志物的表达。抗凋亡标记物BCL2的表达降低以及上皮-间充质转化（EMT）标志物的抑制进一步证实了TRIM11敲低后的细胞凋亡增加和转移能力下降。免疫荧光检测也表明，TRIM11敲低会损害细胞表面丝状伪足的长度和数量。机制上，TRIM11的表达与参与肌动蛋白细胞骨架重组的关键调节因子（如ARP2、ARP3、WAVE2和N-WASP）的表达呈正相关。N-WASP/ARP2/ARP3通路的抑制会抑制CRC细胞中的丝状伪足发育。

引言

结肠癌是全球第二大癌症死亡原因和第三大恶性肿瘤。大多数CRC相关死亡病例是由转移引起的[1]。癌细胞必须成功完成“转移级联”过程，才能在远处形成新的肿瘤：从原发肿瘤部位脱离，迁移到邻近组织，进入血液（内渗），然后在远端位置离开血液（外渗），并在新的位置形成和生长肿瘤。在这一复杂过程中，癌细胞的细胞骨架会发生显著的空间和时间重组，以实现所需的形态和运动性变化[2]。在转移过程中，肌动蛋白丝的重塑对于促进细胞运动至关重要，这会导致膜突起的形成。迁移的肿瘤细胞会产生多种富含肌动蛋白的结构，包括丝状伪足、侵袭伪足、层状伪足、圆状背皱（CDR）和周边皱（PR）[3]。丝状伪足是由肌动蛋白丝束形成的细胞膜细长延伸部分，参与多种生理过程，如血管生成、细胞黏附、细胞间通讯和迁移。在迁移细胞的顶端，丝状伪足作为感觉器官，有助于检测外部刺激。丝状伪足的数量与癌细胞的迁移能力和侵袭性增强相关[4]。膜突起的形成和发展受到肌动蛋白成核因子（如formins、N-WASP家族蛋白和ARP2/3复合物）的调控[5]。WAVE调节复合物的启动和ARP2/3介导的肌动蛋白组装是高效细胞运动的两个关键过程。研究发现，即使在没有WAVE的情况下，膜突起也可以形成，但通常规模较小且数量较少[6]。值得注意的是，实验系统中丝状伪足结构的形成依赖于ARP2/ARP3复合物触发的肌动蛋白成核。

三联基序（TRIM）蛋白超家族包含80多种TRIM蛋白，是已知最大的RING Finger E3泛素连接酶群。这些蛋白通过调节多种生物功能（如细胞生长、发育和分化）在癌变过程中起着重要作用[7]。TRIM55可抑制CRC的发展，其表达水平较低与较差的预后相关。TRIM11与c-Myc相互作用并促进其降解[8]。TRIM31是另一种致癌驱动因子，其抑制可显著抑制CRC的增殖、侵袭、肿瘤生长和转移[9]。同样，TRIM66在CRC中表达上调，其敲低可通过抑制JAK/STAT通路来减少侵袭、增殖、EMT和肿瘤进展[10]。越来越多的证据支持将TRIM11分类为促癌基因，因为它在20多种不同类型的癌症中都过表达并被扩增。TRIM11对基因表达具有显著的组织和情境依赖性，因为它与其他多种转录因子相互作用。研究表明，抑制TRIM11可以在体外和体内减少癌细胞的生长和侵袭能力，同时也具有抑制EMT过程的效果[11]。大多数肿瘤细胞可以在体外基质成分中恢复为癌干细胞（CSC），并重新获得CSC的特性。这些成分有助于F-肌动蛋白细胞骨架的组装，从而触发TRIM11从细胞骨架中的释放。TRIM11通过控制磷酸果糖激酶（PFKs）来调节糖酵解过程，进而重新编程干细胞转录因子[12]。

尽管TRIM11与癌症有关，但其具体影响CRC中肌动蛋白细胞骨架重塑和细胞运动的分子机制仍不清楚。阐明细胞迁移的潜在分子机制非常重要，可能有助于开发新的治疗策略来抑制转移。因此，本研究假设TRIM11通过N-WASP/ARP2/3通路参与丝状伪足的形成和细胞运动。敲低TRIM11可抑制细胞迁移和侵袭，并减少CRC中细胞骨架重组和相关基因的蛋白质合成，进而降低转移能力。

章节片段

使用的抗体和试剂

TRIM11（货号#10851-1-AP）购自Proteintech。β-连环蛋白（货号#E-AB-70005）、LC3A/LC3B（货号#E-AB-61027）、E-钙粘蛋白（货号#E-AB-31261）、p62/SQSTM1（货号#E-AB-70325）、BCL2（货号#E-AB-12288）购自Elabsciences。GAPDH（货号#10-10011）购自Abgenex。次级抗小鼠（货号#7076S）和抗兔（货号#7074S）IgG、Vimentin（货号#3932S）、ARP2（货号#3128）、ARP3（货号#4738）、N-WASP（货号#4848）、WAVE2（货号#3659）购自Cell Signaling Technology（CST）。

基因表达分析揭示了TRIM11驱动的细胞骨架和增殖转录程序

在正常组织和肿瘤样本中检查了TRIM11的转录组表达，结果显示TRIM11在CRC肿瘤样本中的表达高于正常组织，两组之间的差异具有统计学意义（****p<0.0001）（图S1A）。这些数据表明TRIM11的高表达可能与CRC的形成和发展有关。为了探索TRIM11表达在CRC中的预测性重要性，使用了公开可用的数据进行Kaplan-Meier生存分析

讨论

结直肠癌的生长和转移高度依赖于细胞骨架的重塑，这会导致丝状伪足的形成。近年来，TRIM家族蛋白因其在多种癌症类型进展中的关键作用而受到关注[20]。尽管TRIM11与肿瘤生长和转移有关，但其如何控制肌动蛋白细胞骨架重塑仍不清楚。基于计算机的转录组研究提供了关于TRIM11潜在致癌作用的重要信息

研究的局限性

本研究主要在单层细胞系中进行。我们的数据表明TRIM11与自噬的改变有关，但需要更多的自噬流检测和溶酶体抑制实验来确认自噬流的确切参与情况。TRIM11耗尽后，需要分析N-WASP通路的蛋白质表达，并进行共免疫沉淀和泛素化测试，以确定TRIM11是否在生理上与N-WASP相互作用或对其进行泛素化

结论

TRIM11蛋白已知通过促进细胞存活、迁移和侵袭来促进癌症的发展。综合生物信息学数据显示，相关基因包括VASP、FSCN1、PFN1以及MAPK信号通路元件。此外，蛋白质-蛋白质对接研究提示TRIM11与重要的细胞骨架调节因子（如CORO1B和VASP）之间存在有益的相互作用，表明TRIM11可能在控制肌动蛋白动态中起作用。在本研究中，TRIM11的作用

CRediT作者贡献声明

Sandhiya Viswanathan：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、方法学、研究设计、数据分析。Bibhashee Mohapatra：初稿撰写、方法学、数据分析。Atul Anand Bajoria：审稿与编辑、验证、项目管理。Sushree Subhadra Acharya：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学、研究设计。Srinivas Patnaik：审稿与编辑、监督、资源提供、项目管理

未引用参考文献

[15], [16], [17], [18], [19]。

数据可用性

数据可应要求提供

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢卡林加工业技术学院（KIIT，被视为大学）的生物技术学院提供的宝贵支持。Bibhashee Mohapatra得到了印度科学与工业研究委员会（CSIR）的研究奖学金资助。

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