《Journal of Virology》：Characterization of the urinary DNA virome of hematopoietic stem cell transplant recipient and healthy cynomolgus macaques
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BK多瘤病毒（BKPyV）及其他潜伏性DNA病毒感染在造血干细胞移植（HSCT）后常发生再激活，是导致受者出现重大并发症的原因之一，而预防和治疗手段十分有限。毛里求斯食蟹猴（MCM；Macaca fascicularis）因主要组织相容性复合体（MHC）多样性
BK多瘤病毒（BKPyV）及其他潜伏性DNA病毒感染在造血干细胞移植（HSCT）后常发生再激活，是导致受者出现重大并发症的原因之一，而预防和治疗手段十分有限。毛里求斯食蟹猴（MCM；Macaca fascicularis）因主要组织相容性复合体（MHC）多样性有限，是移植研究的重要动物模型。MCM在移植后会出现与人类相似的病毒再激活及疾病并发症，包括多瘤病毒相关出血性膀胱炎和肾病。为明确与上述结局相关的多瘤病毒并刻画更广泛的尿液DNA病毒组，研究人员对健康及HSCT受者食蟹猴的滚环扩增尿液DNA进行了测序，从而对检出的多瘤病毒实现全面的基因组特征分析。经de novo组装与注释，鉴定出三种对食蟹猴具有明显宿主嗜性的多瘤病毒：与人类多瘤病毒亲缘关系密切的Macaca fascicularis polyomavirus 2（MafaPyV2）和Macaca fascicularis polyomavirus 3（MafaPyV3），以及新鉴定的猿猴病毒40株（SV40 type IIB）。三种病毒在HSCT受者和健康动物中均可检出，但在HSCT受者中的相对排出载量显著更高。单个宿主体内常可检出多种多瘤病毒，且在发生泌尿系统疾病的HSCT受者中三种病毒均被检出。综上，该研究进一步阐明了造血干细胞移植毛里求斯食蟹猴中多瘤病毒的多样性、排出情况及疾病关联。
研究背景与问题
在人类中，多种DNA病毒在免疫抑制状态下丰度升高，如HIV/AIDS、肿瘤治疗及实体器官或造血干细胞移植（HSCT）等情形。此类病毒再激活可导致严重疾病，如多瘤病毒、腺病毒或疱疹病毒在原本亚临床感染基础上不受控制地复制，进而引起肾病和出血性膀胱炎。其中，BK多瘤病毒（BKPyV）是一种普遍存在的DNA病毒，在人类泌尿道建立终生感染，移植后可复制至高水平病毒滴度，导致出血性膀胱炎和/或BKPyV相关肾病（BKVN），主要表现为肾功能不全或血尿，并伴病毒细胞病变性损伤的组织学证据。临床发病常需减少免疫抑制，并可能导致移植物排斥和移植物抗宿主病（GVHD）加重。尽管临床影响显著，治疗和预防干预仍极为有限，机会性病毒感染仍是实体器官或HSCT后致病和死亡的主要原因。
非人灵长类因能高度重现人类免疫与生理反应，是移植研究的重要模型。毛里求斯食蟹猴（MCM；Macaca fascicularis）因500多年前引入毛里求斯的奠基种群较小，主要组织相容性复合体（MHC）位点等遗传多样性有限，尤为有价值。此前建立的MCM同种异体HSCT模型已显示可重现人类移植后感染并发症的关键特征，包括由类似人类BKPyV的猕猴多瘤病毒引起的病毒再激活和泌尿系统疾病；部分受者出现血尿、出血性膀胱炎和肾功能不全，偶见组织学病毒细胞病变及肾内多瘤病毒大T抗原免疫反应性。这些动物中检出的病毒历史上被称为"食蟹猴多瘤病毒"（CPV），最早于1999年在肾移植后间质性肾炎的免疫抑制食蟹猴中描述。然而，既往研究依赖大T抗原基因短保守区的PCR和Sanger测序，HSCT受者及健康食蟹猴中循环多瘤病毒的完整基因组组成、多样性和数量尚未明确，病毒间遗传关系、宿主特异性及与疾病的潜在关联亦未完全界定。
研究内容与结论
为此，研究人员对HSCT受者及健康MCM排出的滚环扩增富集DNA病毒组及多瘤病毒多样性、基因组特征进行了全面刻画：采用随机六聚体引物滚环扩增结合Illumina短读长与Nanopore长读长测序，对HSCT受者与健康对照的尿液样本，以及一例重度出血性膀胱炎并多瘤病毒相关肾炎HSCT受者的血浆和脾样本进行回顾性分析；通过de novo基因组组装与注释，解析了多种食蟹猴多瘤病毒的全基因组，刻画其多样性与系统发育基因组学，并评估其在免疫抑制与免疫正常宿主中的流行率和相对丰度。研究结论为：MCM与人类移植受者在病毒再激活和疾病表现上高度平行，确立了该HSCT模型作为研究多瘤病毒生物学、免疫抑制下病毒演化及多瘤病毒相关疾病机制的强有力平台，并可作为有价值的非人灵长类天然病毒—宿主感染模型，用于评估针对移植及泌尿系统疾病背景下多瘤病毒的疫苗和抗病毒药物等防治干预。
主要技术方法
研究纳入80份时间上离散的尿液样本，来自16只HSCT受者MCM和42只健康食蟹猴（34只毛里求斯、6只菲律宾、1只柬埔寨、1只印度尼西亚来源），另采集1只免疫抑制MCM移植后第45天的血浆和脾匀浆样本。关键技术包括：滚环扩增（RCA）富集环状DNA；Illumina短读长与Nanopore长读长测序；de novo组装与注释（MEGAHIT、BLASTn、DIAMOND、Cenote-Taker2）；变异检出（LoFreq、bcftools、SnpEff）及AlphaFold结构预测；二核苷酸/三核苷酸基序富集与突变特征分析（马尔可夫建模）；系统发育分析（MAFFT、FigTree）。
研究结果
HSCT受者与健康食蟹猴的尿液DNA病毒组：对80份尿液样本RCA测序数据的de novo组装与注释显示，两组尿液病毒组组成差异明显。HSCT受者累积尿液病毒组以多瘤病毒为主，其后为噬菌体、系统发育未分类病毒、CRESS DNA病毒和指环病毒；较低相对丰度还检出乳头瘤病毒、细小病毒、疱疹病毒、varidnavirus、caudoviricetes和哺乳动物腺病毒。健康对照累积以噬菌体、未分类病毒和CRESS DNA病毒为主，多瘤病毒、指环病毒等相对丰度低。HSCT受者样本中多瘤病毒和指环病毒占病毒读数的比例分别为62.1%和2.6%，显著高于健康对照的0.16%和0.11%。HSCT受者中多瘤病毒读数优势主要由CM67和CM69两只动物的5份样本驱动；健康动物平均相对丰度仅320 VRPM，HSCT受者为137,000 VRPM，排除CM67和CM69后仍为5,359 VRPM。
三种多瘤病毒的鉴定与基因组特征：鉴定出MafaPyV2、MafaPyV3和SV40 type IIB，三者均见于HSCT受者与健康对照。与既往CPV短Sanger序列比对显示，这些历史序列实际代表MafaPyV2和SV40 type IIB两种不同病毒。MafaPyV2是迄今与BKPyV亲缘最近的病毒之一，核苷酸同一性83%，最近亲为Cercopithecus erythrotis polyomavirus（84.6%）；基因组为5,164 bp环状，早期与晚期编码基因反向、具双向启动子（非编码控制区，NCCR）；基于VP1序列可分为三种基因型（I–III），两组的基因型分布无明显差异；在58只食蟹猴中检出率55%（32/58），HSCT受者75%、健康动物48%，HSCT受者相对载量较健康对照升高686倍。SV40 type IIB与SV40 type II核苷酸同一性96.9%，与SV40 type I同源性88%；具完整VP1覆盖的样本（14只毛里求斯和1只柬埔寨来源）共识序列间无基因组变异；HSCT受者与健康动物检出率相近（56% vs 59%），但HSCT受者相对载量高200倍以上。MafaPyV3与人类WU多瘤病毒最近（82.2%），与WU、KI多瘤病毒类似缺乏agnoprotein开放阅读框（ORF）；自两只HSCT受者MCM组装出4个完整基因组，VP1内无遗传变异；总检出率34%（20/58），HSCT受者56%、健康动物26%，HSCT受者相对载量升高超过1,000倍。不同地理来源动物的病毒检出情况亦有描述：2只印尼来源仅检出MafaPyV3，2只柬埔寨来源检出MafaPyV2和SV40 type IIB，菲律宾来源三种均存在。共排出分析显示，全部样本中MafaPyV2与SV40 type IIB共排出高于随机（q = 0.0039），但按组分层后不显著；健康动物中MafaPyV2与MafaPyV3呈显著互斥（q = 0.021），HSCT动物及全队列未见。
HSCT受者毛里求斯食蟹猴的泌尿系统疾病与相关多瘤病毒：7只HSCT受者MCM出现泌尿系统临床体征和/或移植后泌尿系统尸检诊断，包括肉眼或镜下血尿，尸检见肾炎（±大T抗原免疫反应性）和/或膀胱炎（±出血性）；这些动物常伴厌食和体重下降，2只有尿液样本的动物生前证实病毒血症或病毒尿症；7只受者发生急性皮肤和/或多器官GVHD。7只泌尿系统疾病动物均排出一种或多种多瘤病毒。CM67和CM69相对病毒载量极高，CM67证实多瘤病毒相关肾炎和膀胱炎，尿中排出全部三种病毒，以MafaPyV2为主、MafaPyV3极少；CM69有轻度肾小管损伤和肾炎，亦排出三种病毒，以SV40 type IIB为主、MafaPyV3极少。其余5只有泌尿系统体征/疾病的动物病变较轻，疾病与高水平多瘤病毒排出不对应。健康对照总体多瘤病毒相对丰度较低，以SV40 type IIB为主。另1只无尿液样本的HSCT受者MCM尸检诊断重度出血性膀胱炎和多瘤病毒相关肾炎，血浆测序未检出多瘤病毒（可能因DNA浓度低），脾DNA测序仅检出SV40 type IIB，但脾组织未见大T抗原免疫反应性，可能为非复制部位。
食蟹猴多瘤病毒的宿主间与宿主内变异：采用LoFreq与snpEff进行变异检出与编码区注释。MafaPyV2变异见于NCCR及所有编码区；宿主间变异多为同义替换（65个独有同义变异），错义变异较少（20个独有错义变异），按基因长度归一化后独有错义变异最常见于agnoprotein（19.0个/kb）、VP2（4.7个/kb）和VP1（3.7个/kb）。VP1中3个宿主间错义变异区分基因型II与I；其中残基64的G > T突变致谷氨酸变为天冬氨酸，位于表面环，在HSCT受者尿中出现频率为健康对照的3倍（nHSCT = 3，nControl = 1）；另两个变异在两组中以相似频率出现：残基188的A > C致VP1表面中性谷氨酸→天冬氨酸，残基156的G > T致内层β折叠丙氨酸→丝氨酸。来自多瘤病毒相关肾炎动物的基因型I毒株CM67.2，在残基188存在低频（0.008 AF）G > A突变，致谷氨酸→赖氨酸、电荷由负转正。VP1宿主内错义变异与上述4个宿主间变异重叠。因Illumina测序深度和覆盖度低，CM79和CM80的MafaPyV2变异改用长读长序列经minimap2、bcftools和snpEff分析；CM80的MafaPyV2属分化最大的基因型III，相对基因型I有6个VP1错义变异，包括与基因型II相同的Glu64Asp和Ala156Ser，以及额外5个变异致4个氨基酸改变（Asn63Ser、Thr79Ala、Thr133Ala、Thr177Ala、Thr177Arg）；该样本来自间歇性血尿开始5个月后的动物，未死于疾病且仍存活。CM79的MafaPyV2 VP1仅检出区分基因型II与I的3个错义变异。大T抗原方面，MafaPyV2宿主间与宿主内错义变异重叠，13只动物16份样本中检出7个变异，6个见于两组，1个仅见于1只健康对照；CM79和CM80另检出13个大T抗原错义变异。NCCR中宿主间单核苷酸变异（SNV）遍布早期和晚期区域，推定TATA盒出现单核苷酸插入或缺失，见于HSCT受者5只动物9份样本和1只健康对照；3个宿主内SNV见于5份HSCT受者样本（CM64和CM69两只动物）。SV40 type IIB仅见3个宿主间错义变异，均位于大T抗原，见于1只健康对照和1只HSCT受者；1只健康动物（CM11）的SV40 type IIB在NCCR有4个宿主间SNV和1个宿主内SNV；CM81脾中SV40 type IIB未见变异。MafaPyV3所有变异均见于HSCT受者，包括VP1和VP2各1个错义变异；CM64.2的NCCR有1个宿主间和宿主内SNV。三种多瘤病毒基因组中偶见导致移码或无义突变的插入缺失；de novo组装未检出NCCR的大规模重排、缺失或重复。
宿主内多瘤病毒遗传变异的时间动态：对7只HSCT受者MCM和12只健康食蟹猴的纵向尿液样本（每只2–3个时间点）评估。单份尿样常同时排出多种多瘤病毒，纵向样本间排出偶呈间歇性；19只有多个采样时间点的动物中，分别有10、5、4只间歇排出MafaPyV2、SV40 type IIB、MafaPyV3。仅3只HSCT受者在多个时间点有多瘤病毒检出且覆盖度足够用于变异分析。样本67.2（伴病毒尿症和病毒血症检出）出现MafaPyV2 VP1表面暴露螺旋上的独有错义变异Glu188Lys（0.008 AF），早期时间点（CM67.1）不存在。CM69在CM69.1-2与CM69.3（尸检样本）间MafaPyV2变异较大，在全基因组系统发育树上分属不同分支；因CM69.3的VP1覆盖度低，两者间未检出VP1错义变异，这提示可能是新毒株感染或既有基因型I共感染在后期扩增，而非宿主内演化。CM64早期时间点（CM64.1；HSCT后29天）未检出MafaPyV2，而CM64.2与64.3（HSCT后52天同一次采集的两份分装）宿主内错义变异不同：CM64.3多1个VP1错义变异和3个大T抗原错义变异，CM64.2和64.3共有1个VP2独有错义变异，CM64.2另有1个大T抗原错义变异不见于CM64.3。
食蟹猴多瘤病毒显示长期APOBEC3选择压力证据：许多人类DNA病毒（包括多瘤病毒）具宿主APOBEC3胞苷脱氨酶长期选择压力所致的基因组特征，表现为APOBEC3靶二核苷酸耗竭。研究人员以马尔可夫建模按观测值/期望值计算TC/TT与GA/AA二核苷酸富集：TC和GA分别代表正负链上可被APOBEC3靶向的3′胞嘧啶，TT和AA为脱氨及DNA复制产物。三种基因组均显示TC:GA二核苷酸耗竭和TT:AA二核苷酸过表达；TC与GA二核苷酸密度呈与复制和转录方向相对应的反向关系。为评估潜在持续突变过程，研究人员分析样本内变异的三核苷酸上下文：MafaPyV2多数突变按三核苷酸丰度归一化后发生于CpG位点；MafaPyV3基因组仅见TCA、TCT和CCG三核苷酸处的C > T和C > G突变，可能代表APOBEC3突变特征，但变异频率低使其意义不明；SV40 type IIB未见APOBEC3介导的突变特征。
讨论与结论
该研究广泛评估了RCA富集的DNA病毒组，并以短读长与长读长互补测序全面刻画免疫抑制与健康食蟹猴尿液多瘤病毒的遗传特征，鉴定出三种对食蟹猴具明显嗜性的β多瘤病毒。MafaPyV2与SV40 type IIB此前均被称为CPV，完整基因组分析澄清二者为不同病毒。MafaPyV2因与BKPyV高度的基因组和蛋白同源性、相似的遗传变异性及与泌尿道疾病的关联，可能代表BKPyV的类似物；SV40 type IIB可能是食蟹猴特有的SV40株。MafaPyV3最近亲WU多瘤病毒主要见于免疫抑制人类的呼吸道分泌物、罕见于尿液，疾病关联不明；鉴于二者核苷酸同源性低，MafaPyV3是否同样感染呼吸道或泌尿道为主要感染部位尚不清楚，需对其他组织样本筛查及感染性研究。队列中三种病毒虽在免疫抑制与免疫正常猕猴中均检出，但HSCT受者相对病毒载量高数百至数千倍，与人类HSCT受者中免疫抑制允许BKPyV等潜伏多瘤病毒再激活和不控制复制的情况高度平行；指环病毒亦见23.6倍的中度升高，其在人类中被视为免疫抑制标志物但主要富集于血液。所有出现泌尿系统疾病临床或组织病理学证据的HSCT受者均排出一种以上多瘤病毒，单宿主常同时检出多种；疾病表型最重的两只动物MafaPyV2和/或SV40 type IIB相对载量极高，支持病毒载量参与疾病严重程度的模型，与人类高水平BKPyV病毒尿症和病毒血症与出血性膀胱炎或肾病的强关联相似；而泌尿系统病变较轻的动物病毒载量普遍较低，提示仅检出多瘤病毒不足以预测疾病结局，正如人类病毒血症本身也不足以预测肾病。由于研究依赖回顾性生前尿液采样和尸检诊断，结果未确立单个多瘤病毒与特定疾病表型的因果关系。
VP1是多瘤病毒主要衣壳蛋白，为细胞表面受体结合的主要决定因素和宿主抗体反应的主要靶点。研究检出若干位于表面暴露或结构重要区域的错义变异。人类BKPyV中类似VP1多态性影响受体使用、细胞嗜性和中和抗体敏感性，提示MafaPyV2 VP1变异可能同样调节病毒适应度或免疫逃逸；某些VP1变异在HSCT受者中比健康对照更常见，提示免疫抑制可能允许功能特性改变的病毒亚群扩增或持续，但受动物数量有限和测序深度不一所限，这些解释仍属推测，需功能研究验证受体结合、抗体中和和细胞类型特异性。相比之下，SV40 type IIB和MafaPyV3遗传多样性有限；SV40 type IIB的低多样性可能反映作用于该病毒的致突变过程有限，或宿主约束较强使任何变异都大幅降低适应度。
三种食蟹猴多瘤病毒均显示长期APOBEC3介导选择压力特征，与人类多瘤病毒所见一致，支持APOBEC3酶在进化时间尺度上塑造多瘤病毒基因组组成的保守作用。与人类疾病报道不同，宿主内病毒变异水平的APOBEC3介导突变证据有限且不一致，提示APOBEC3虽在长期对病毒演化有可测影响，但在活动性感染中可能仅偶发参与突变过程；这也可能因猕猴APOBEC3B位于胞质，感染时对病毒染色质无或仅有有限可及性。因此，表观的APOBEC3靶点耗竭基因组组成可能代表祖先瓶颈而非当前活跃过程，尚需进一步研究确定。
多瘤病毒（尤其β属）多被认为与宿主缓慢共同演化、种间传播有限。基于BKPyV与其最近亲Pan troglodytes verus polyomavirus的分支长度，并假设其分化时间与P. troglodytes verus和人类分化时间（5–6 Mya）相近，SV40 type IIB与SV40 type I分化约在2.7–4.2 Mya，与SV40 type II分化约在0.56–0.81 Mya。这些数据表明SV40 type IIB在食蟹猴物种形成之后出现，且鉴于其在恒河猴中缺失，很可能是食蟹猴特有病毒。
食蟹猴原产于中国南部、印度东部至东南亚及印度尼西亚群岛。17世纪约10–20只奠基种群被引入毛里求斯，现已增至逾30,000只。这一显著瓶颈被用于利用其有限遗传多样性的免疫学研究，也为地理隔离的病毒分化提供机会。研究特意纳入不同地理来源猕猴以探讨是否存在地理特异的病毒、株或谱系；未观察到此类现象，可能反映多瘤病毒缓慢的演化动态，也可能与圈养和共舍或对照动物排出量低有关。该队列的多样性和感染频率是否适用于野生动物尚需研究。
人类HSCT受者尿液宏基因组分析仍有限，临床监测多限于BKPyV、JC多瘤病毒和腺病毒的PCR等靶向方法；而肾移植患者尿液鸟枪法宏基因组分析揭示包含多瘤病毒、乳头瘤病毒、指环病毒和疱疹病毒的多样病毒组。免疫正常人类尿液病毒组通常以噬菌体为主，真核DNA病毒读数相对较少，与本食蟹猴队列的病毒组组成高度相似，凸显MCM HSCT模型研究免疫抑制宿主机会性病毒感染转化的相关性。
异基因HSCT后感染并发症（尤其BKPyV相关疾病）的管理仍具挑战，缺乏特异性抗病毒药物和预防措施。约10%–29%的异基因HSCT患者在植入后发生BKPyV相关出血性膀胱炎，且与尿中高BKPyV载量相关；重度出血性膀胱炎还与总生存下降和移植相关死亡风险增加相关。MCM中类似病毒再激活和泌尿系统疾病的发现提供了小鼠无法重现的有价值实验系统：鼠细胞不允许BKPyV生产性感染，小鼠多瘤病毒为α多瘤病毒、致癌驱动因子（中T抗原）不同且致病机制相异，小鼠亦仅编码单一APOBEC基因、缺乏灵长类APOBEC3酶多样性。总体而言，该研究刻画了食蟹猴尿液中的多瘤病毒及更广泛病毒组，确立毛里求斯食蟹猴HSCT模型作为研究多瘤病毒再激活、宿主免疫应答、病毒演化和干预策略的转化平台。
