《Compounds》：Exploratory Chemical Fingerprinting of the Pulp and Peel of Selenicereus setaceus by Positive-Ion Mode Paper Spray Mass Spectrometry
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Selenicereus setaceus 是巴西塞拉多（Cerrado）原生仙人掌物种，其植物化学成分在很大程度上仍未被探索。本研究采用纸喷雾质谱（PS-MS）考察了采自巴西两个地区的 S. setaceus 果肉与果皮的正离子化学指纹图谱，并评价了三种提取
Selenicereus setaceus 是巴西塞拉多（Cerrado）原生仙人掌物种，其植物化学成分在很大程度上仍未被探索。本研究采用纸喷雾质谱（PS-MS）考察了采自巴西两个地区的 S. setaceus 果肉与果皮的正离子化学指纹图谱，并评价了三种提取策略（浸渍法、超声辅助提取、Ultra-Turrax 匀浆）对检测到的化学轮廓的影响。商业栽培的 Selenicereus undatus 被纳入作为比较。基于前体离子、串联质谱（MS/MS）裂解模式及与既往报道数据的比对，初步注释了25种化合物。甜菜素（betalains）为检测到的主要代谢物类别，尤其在果皮中，观察到多种脱羧与脱氢甜菜花青素（betacyanin）衍生物。黄酮类、苯丙素类、苯甲酸衍生物、寡糖及糖苷亦被初步归属。在 S. setaceus 中检测到与橙皮苷（hesperidin）、原儿茶酸-O-己糖苷（protocatechuic acid-O-hexoside）及芍药苷（paeoniflorin）相容的离子，扩展了目前该未充分探索物种可获得的植物化学信息。采自联邦区（Federal District）果实的果皮表现出最多数量的初步注释化合物，凸显其作为未来价值化生物活性代谢物来源的潜力。探索性多元分析进一步揭示了果皮与果肉指纹图谱之间以及不同提取程序之间的差异，尽管总体分析轮廓大体可比。由于本研究仅限于正离子模式 PS-MS 且化合物归属基于初步注释，所报道的指纹图谱应被解读为探索性而非全面的代谢组学轮廓。尽管如此，结果证明正离子模式 PS-MS 为未充分探索的巴西本土果实的化学指纹图谱提供了快速有效的平台，并为 S. setaceus 贡献了新的植物化学信息。
一、研究背景与问题
巴西塞拉多（Cerrado）是全球生物多样性热点地区之一，蕴藏丰富的本土果实物种资源，具有营养、经济和生物技术潜力。尽管将这些果实作为食品配料和生物活性化合物的可持续来源日益受到关注，许多物种在化学层面仍未被充分探索。扩展对这些本土资源的植物化学认识，不仅有助于识别具有营养与功能意义的化合物，也有助于推动其农工业价值化、支持地方生产体系，并通过本土植物资源的可持续利用促进生物多样性保护。
在塞拉多原生仙人掌物种中，Selenicereus setaceus（俗称 saborosa、mini pitaya 或 baby pitaya）是一种有前景但仍未充分利用的果实。其白色果肉含大量可食用种子，甜而多汁，感官特征独特，适于鲜食及制作果汁、果酱和冰淇淋。然而，尽管具有营养与商业潜力，S. setaceus 的植物化学成分仍表征不足。迄今已有研究主要集中于其近似成分和挥发性成分，而关于其特殊代谢物的信息仍然有限。对火龙果物种的研究已证明存在广泛的酚类化合物，包括苯丙素类、绿原酸、咖啡酸和芥子酸，山奈酚和芦丁等黄酮类，以及苯甲酸、原儿茶酸和鞣花酸衍生物。这些代谢物因报道的抗氧化、抗炎等生物活性及潜在健康益处而备受关注，凸显了在 S. setaceus 等未充分探索物种中研究其存在的必要性。
仙人掌果实中另一类重要的特殊代谢物是甜菜素（betalains），包括甜菜花青素（betacyanins）和甜菜黄素（betaxanthins），分别赋予果实特征性的红紫色和黄橙色。除决定果实颜色外，甜菜素因细胞毒性、抗焦虑、抗氧化与抗凋亡、抗肥胖与胰岛素增敏及抗炎等多种生物活性而受到关注；其高稳定性和强烈着色使其成为食品应用中颇具吸引力的天然色素，提升了工业相关性。
对这些生物活性化合物的高效表征不仅取决于所采用的分析平台，也取决于提取策略。溶剂选择对代谢物回收起关键作用，甲醇因其能提取涵盖广泛极性的化合物而成为植物代谢组学中最广泛使用的溶剂之一。除溶剂组成外，提取程序本身也可显著影响所得化学轮廓。传统浸渍法简单但常需较长提取时间和较大溶剂体积，其效率可能受溶剂向植物基质渗透缓慢的限制。Ultra-Turrax 匀浆通过高速机械破碎增强传质，缩短提取时间并促进溶剂与植物组织的更均匀接触；超声辅助提取则通过声空化改善溶剂渗透，增加提取溶剂与植物基质间的相互作用并促进代谢物释放。
在可用于植物代谢物快速表征的分析方法中，纸喷雾电离质谱（PS-MS）已成为一种简单、快速、成本有效的常压电离技术，适用于探索性植物化学研究。该技术可实现最少样品制备的直接分析、化学指纹图谱的快速采集、分析成本降低以及几乎不产生化学废物。这些特点使 PS-MS 特别适用于涉及不同植物基质或提取程序的比较性指纹图谱研究。然而，PS-MS 应被视为补充性分析工具，而非色谱平台与高分辨质谱联用（ESI-HRMS）的替代，后者在需要全面代谢组覆盖或明确结构解析时仍是首选方法。
塞拉多目前是全球受威胁最严重的生物多样性热点地区之一，面临森林砍伐、气候变化、生境破碎化、水资源退化及农业扩张日益增加的压力。在此背景下，研究 S. setaceus 等特有果实的植物化学成分，不仅对识别具有营养和生物学意义的化合物很重要，也有助于促进本土物种的可持续价值化。尽管具有生态和商业潜力，S. setaceus 的植物化学成分仍表征不足，且据研究人员所知，尚无研究采用纸喷雾质谱考察其果实各部分的化学指纹图谱。因此，本研究的目标是获得采自巴西不同地区的 S. setaceus 果肉与果皮的探索性正离子 PS-MS 指纹图谱，将其与商业栽培的 Selenicereus undatus 的轮廓进行比较，并评价不同提取策略在所采用分析条件下对所得化学指纹图谱的影响。
二、主要关键技术方法
研究人员采集两个巴西地区（Espírito Santo 的 Concei??o do Castelo 与联邦区 Brasília）充分成熟果实，并取商业栽培 S. undatus（Minas Gerais 州 Vermelho Novo 种植者）同成熟期果实，手工分离为果皮与果肉（含种子），?18 °C 保存；遗传资源获取在巴西 SISGEN 系统登记（编号 A391F42）。样品经电动研磨后，以 8 mL 甲醇按三种策略提取（浸渍 4 °C 24 h、超声浴 15 min、Ultra-Turrax 16 000 rpm 2 min），离心取上清。分析采用配备纸喷雾电离源的 LCQ Fleet 离子阱质谱仪，正离子模式，喷雾电压 +4.5 kV、毛细管电压 40 V、传输管温度 275 °C、管透镜电压 120 V、质量范围 m/z 100–1000、MS/MS 碰撞能量 15–45 eV、采集 15 次扫描；以 Whatman Grade 1 Chr 色谱纸裁成边长 1.5 cm 等边三角形为基底，每次分析沉积 2.0 μL 提取液后加 40 μL 甲醇启动喷雾，全部测定三次重复。数据经 Xcalibur 处理，化合物通过前体离子与 MS/MS 裂解模式同文献比对初步注释。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Bonferroni 多重比较检验（p < 0.05，SPSS 15.0），并以均值中心化数据进行主成分分析（PCA，MATLAB R2021a 与 PLS Toolbox 8.9）。
三、研究结果
3.1 注释流程与化合物概况：研究人员先采集全扫描质谱，选取最强200个离子与既往报道的仙人掌科及相关植物基质化合物进行初筛，再对候选前体离子进行靶向 MS/MS 以获得诊断性裂解模式，仅考虑前体离子 m/z 505 碰撞诱导解离期间及之后产生的碎片离子用于裂解途径解析。以 m/z 505 为例，碰撞诱导解离产生 m/z 343 和 299 的特征产物离子，其裂解模式与 Hylocereus polyrhizus 果肉中鉴定的甜菜素 17-脱羧-新甜菜苷（17-decarboxy-neobetanin，表1化合物11）一致。据此流程，共初步注释25种化合物，涵盖甜菜素、酚类化合物、碳水化合物和糖苷。
3.2 甜菜素为主导类别：甜菜素约占全部检测代谢物的60%，且多数甜菜素相关离子在果皮中检出，表明该组织是所分析果实中这些色素的主要储库，与既往报道甜菜素为火龙果物种主要特殊代谢物一致。25种化合物中15种归属甜菜素类，包括 hylocerenin、phyllocactin、neobetanin 和 betanin 的衍生物；多数此前已在 Hylocereus 物种中报道，而 6′-O-malonyl-2-decarboxyisobetanin 和 isoindicaxanthin 此前在 Stenocereus 果实中描述。
3.3 脱羧与脱氢衍生物：检测到的甜菜素轮廓的显著特征是存在多种脱羧和脱氢甜菜花青素衍生物。这些化合物此前已被描述为火龙果中天然存在的色素，但也可能源于样品制备和分析过程中天然甜菜素的部分降解；脱羧和脱氢反应据报道可在水性和醇性介质的热与氧化条件下发生。鉴于本研究采用甲醇提取及样品处理中暴露于氧气，这些衍生物的天然存在与其在样品加工中的部分形成均应视为合理解释。提取程序本身也可能促成了部分甜菜素的结构修饰：超声辅助提取通过声空化产生局部高能微环境和活性氧，可能增加提取介质的氧化潜力；Ultra-Turrax 匀浆对植物组织施加强烈机械破碎并增加溶剂中氧的掺入，这些条件可能有利于敏感色素的氧化降解；相比之下浸渍法是较温和的提取程序，预期能更好地保持甜菜素的天然分子结构。因此，单脱羧和双脱羧衍生物以及 betanin、neobetanin、phyllocactin 和 hylocerenin 的脱氢形式的出现，与既往描述的甜菜素在氧化和加工条件下的降解途径相符。
3.4 酰化甜菜花青素与甜菜黄素：neophyllocactin、phyllocactin、2′-O-apiosyl-phyllocactin、5″-O-E-feruloyl-2′-O-apiosyl-phyllocactin、2,17-bidecarboxy-neophyllocactin 及脱氢脱羧-新叶绿亭等属于 Hylocereus 物种特征性酰化甜菜花青素；酰化已知可提高色素稳定性，5″-O-E-feruloyl-2′-O-apiosyl-phyllocactin 中的阿魏酰基部分与甜菜素的分子内稳定化相关。注释的 hylocerenin 衍生物——包括 2,17-bidecarboxy-isohylocerenin、2,17-bidecarboxy-neohylocerenin 和脱氢脱羧-新 hylocerenin——代表紫色火龙果中报道的主要酰化甜菜花青素之一的结构修饰。除甜菜花青素外，isoindicaxanthin 被初步注释为甜菜黄素亚类的唯一代表；甜菜黄素是由甜菜醛酸与氨基酸缩合形成的黄橙色含氮色素，对仙人掌果实的抗氧化能力有重要贡献。
3.5 非甜菜素代谢物：除甜菜素外，正离子 PS-MS 还初步注释了黄酮类、苯丙素类、羟基肉桂酸、苯甲酸衍生物、碳水化合物和糖苷类化合物。由于分析仅在正离子模式进行，优先以去质子化形式电离的化合物可能被低估，因此未检出某离子不应解释为该代谢物在果实中不存在；对羟基苯甲酸衍生物、原儿茶酸-O-己糖苷、咖啡酰-O-己糖苷和香豆酰奎宁酸的注释应视为初步且仅由本研究的正离子 MS/MS 证据支持。在非甜菜素代谢物中，果皮和果肉样品均检测到与橙皮苷相容的离子；橙皮苷是一种因对糖脂代谢的有益作用和抗炎活性而被广泛研究的黄酮类。原儿茶酸-O-己糖苷在几乎所有分析样品中检出，与抗菌、抗糖尿病、抗衰老和抗炎活性相关。与芍药苷相容的离子仅在联邦区采集的 S. setaceus 果肉中检出，据研究人员所知为该物种中该代谢物的首次报道；芍药苷因报道的神经保护和心脏保护特性而备受关注。此外，二羟基香豆素-O-葡萄糖苷的初步注释提示可能存在东莨菪内酯（scopoletin）衍生物，其苷元已显示对 HeLa 细胞的抗增殖活性。蔗糖和麦芽四糖等碳水化合物亦被检出，印证了既往关于火龙果果实可溶性糖的报道。
3.6 部位与产地差异：化学指纹图谱在果实部位和采集地点间差异显著，不仅见于果皮与果肉之间，也见于 Espírito Santo 与联邦区采集的 S. setaceus 样品之间。这种变异性在预期之中，因为火龙果果实种内和种间存在相当遗传多样性，其代谢物组成受基因型、地理来源、气候条件、农业实践、采收成熟度和采后处理的强烈影响。S. setaceus 原产于塞拉多，该生物群落以强烈太阳辐射、季节性干旱、贫瘠土壤和显著环境胁迫为特征；这些条件已知可刺激参与光保护和氧化胁迫耐受的次生代谢物（包括酚类化合物和甜菜素）的生物合成。因此，本研究中观察到的甜菜素衍生物多样性（尤其在果皮中）可能反映该物种对其自然环境的适应性代谢响应；但由于未考察环境变量，这一解释仍属推测，应在未来研究中加以探讨。总体而言，PS-MS 获得的化学指纹图谱提示 S. setaceus 具有至少与商业栽培火龙果物种同样复杂的植物化学成分。
3.7 提取方式的影响：在所有评价样品中，联邦区采集的 S. setaceus 果皮表现出最大的化学多样性，无论提取方法如何均产生最多数量的初步注释化合物，强化了该副产物作为生物活性代谢物有前景来源的潜力。果皮持续表现出比 ES 和 UN 果实相应果肉部分更多数量的初步注释化合物，这与既往报道一致：火龙果果皮可占果实质量的33%，通常比可食用果肉更富含次生代谢物；果皮虽在农工业加工中常被丢弃，但含有较高浓度的酚类化合物、黄酮类、单宁、甜菜素、膳食纤维和果胶，而果肉通常以较高的可溶性糖、维生素 C 和特定色素含量为特征。作为果实的主要保护屏障，果皮积累参与防御环境胁迫和生物挑战的特殊代谢物；在仙人掌物种中，这些化合物有助于抵御太阳辐射、氧化胁迫、衰老以及微生物和食草动物侵袭。提取方法也影响不同果实部位检测到的化合物数量：对联邦区 S. setaceus 果皮，甲醇浸渍（M）产生最多数量的初步注释化合物，而超声辅助提取（U）与 Ultra-Turrax 匀浆（T）之间无显著差异；相反，Ultra-Turrax 提取在 ES 样品和商业 S. undatus 果皮中产生最多检测化合物，其优越性能可归因于对植物基质的强烈机械破碎，增强溶剂渗透和传质从而提高代谢物提取效率；超声辅助提取则在联邦区果肉和商业 S. undatus 果肉中产生最多检测化合物，表明每种提取策略的有效性取决于植物基质和分析组织。
3.8 多元统计分析：研究人员对正离子 PS-MS 获得的离子强度进行探索性主成分分析，以评价果实部位、地理来源和提取方法对样品总体化学轮廓的影响。探索性 PCA 模型解释总方差的43.27%，前两个主成分分别占26.56%（PC1）和16.71%（PC2）。尽管解释方差百分比在涉及复杂生物基质的非靶向指纹图谱研究中属典型水平，得分图揭示果皮与果肉样品之间存在明显分离趋势：多数果皮提取物沿 PC1 正侧分布，而果肉样品主要与 PC1 负得分相关，表明两个果实部位具有不同的化学指纹图谱。相应载荷图显示，m/z 339、593、607、611、635 和 705 的离子对与果皮样品相关的正得分贡献最强；相反，m/z 399 的离子是沿 PC1 负侧驱动果肉样品聚类的主要变量。尽管观察到两个部位间的部分重叠，沿 PC2 仍可见进一步区分，果肉样品倾向于在负得分处聚集；据载荷图，m/z 339、593 和 769 的离子是与该分离相关的主要变量。总体而言，PCA 结果表明尽管生物样品存在固有变异性，果皮的化学组成与果肉持续不同；这些发现印证了化合物注释结果所显示的果皮中特殊代谢物多样性更高，并进一步支持正离子 PS-MS 基于化学指纹图谱快速区分果实组织的适用性。PCA 与层次聚类分析（HCA）揭示一致的探索性模式，表明两种多元方法总体吻合；果肉样品倾向于更紧密聚类，而果皮样品在多元空间中分散更广，反映其化学指纹图谱更大的变异性，这与整个研究中果皮初步注释的代谢物数量和多样性更大相一致。然而，鉴于样品数量和采集地点有限，观察到的变异性应谨慎解读，不能将任何生物学、地理或环境因素明确归因于聚类模式。
四、讨论与结论
讨论：研究人员将甜菜素占主导的检测结果与既往火龙果研究相联系，指出其除贡献果实着色外，还具有抗氧化、抗炎、细胞保护等健康促进作用，凸显 S. setaceus（尤其果皮）作为天然生物活性化合物来源的植物化学意义。对脱羧和脱氢甜菜花青素衍生物，研究人员同时考虑其天然存在与加工过程中形成的可能性，并将超声空化和 Ultra-Turrax 匀浆带来的氧化条件与浸渍法的温和性相对比，认为结果与既往描述的甜菜素氧化和加工降解途径相符。酰化甜菜花青素（如含阿魏酰基的衍生物）被指出与色素稳定性及分子内稳定化相关，hylocerenin 衍生物则代表紫色火龙果主要酰化甜菜花青素的结构修饰，共同说明 S. setaceus 甜菜素轮廓的化学复杂性。对非甜菜素代谢物，研究人员强调正离子模式的局限，即优先以去质子化形式电离的化合物可能被低估，未检出离子不应视为代谢物不存在，相关注释仅为初步。果皮较果肉更富含次生代谢物的结果被解释为果皮作为保护屏障积累防御相关代谢物的体现，并支持其作为食品和生物技术应用植物化学物来源的潜力。关于产地与环境，研究人员指出塞拉多的强辐射、季节性干旱和贫瘠土壤可能刺激酚类与甜菜素的生物合成，但因未考察环境变量，该解释仍属推测。在提取方法上，研究人员认为各策略的有效性取决于植物基质和组织类型，Ultra-Turrax 的优势源于机械破碎增强的溶剂渗透与传质。多元分析方面，研究人员指出果皮样品分散更广与其代谢物数量和多样性更大相一致，但受样品数量和采集地点限制，不能将聚类模式明确归因于生物、地理或环境因素。研究还明确 PS-MS 应作为补充工具，而非高分辨色谱-质谱的替代。
结论：正离子模式纸喷雾质谱（PS-MS）被证明是 Selenicereus setaceus 探索性化学指纹图谱的快速有效分析方法，能够基于代谢物轮廓区分果皮与果肉。在所分析部位中，果皮持续表现出比果肉更大的化学多样性，以初步注释的甜菜素、黄酮类和其他酚类化合物为主；这些发现强化了这一常被丢弃副产物的植物化学相关性，并凸显其作为未来食品、营养保健品和农工业应用生物活性化合物来源的潜力。共初步注释25种属于不同化学类别的化合物，包括若干脱羧和脱氢甜菜素衍生物，从而扩展了目前对这一未充分探索的巴西本土物种可获得的植物化学知识。尽管在提取程序和采集地点之间观察到差异，所评价的提取方法产生的化学指纹图谱大体可比，且有限的采样设计不允许将观察到的变异性归因于地理、环境或生理因素。由于化合物注释基于标称前体离子、MS/MS 裂解模式及与既往发表数据的比较，所有归属均应视为初步。此外，仅使用正离子模式限制了本研究实现的代谢物覆盖，因为优先在负离子模式电离的化合物可能被低估。未来采用互补分析平台——特别是双电离模式操作的高分辨液相色谱-质谱（LC-MS）——并结合真实参考标准的研究，对确认化合物身份和实现 S. setaceus 代谢组更全面表征将十分重要。总体而言，本研究证明正离子 PS-MS 可作为快速、低成本且环境友好的分析工具，用于未充分探索的巴西本土果实的探索性化学指纹图谱研究；除扩展 S. setaceus 的植物化学知识外，这些结果为未来研究该物种的营养、功能和工业潜力奠定了基础。
