基于流式细胞术定量评估临床相关抗呼吸道合胞病毒F蛋白单克隆抗体对合胞体形成的抑制效力与常规中和效价呈现不同特征

《Journal of Virology》：Clinically relevant RSV anti-F antibodies exhibit comparable inhibition of syncytium formation despite marked differences in neutralization potency

　　

**摘要**

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是婴幼儿、免疫受损人群和老年人下呼吸道感染的主要病原体。RSV感染的一个标志性特征是感染性细胞与相邻未感染细胞之间发生膜融合，形成多核合胞体（syncytium）。这一过程由感染细胞表面表达的RSV融合蛋白（RSV fusion protein, RSV F）介导，该蛋白与邻近细胞表面的受体相互作用，驱动膜融合。合胞体形成可能促进病毒在细胞间的传播，同时减少病毒颗粒暴露于细胞外中和抗体和免疫细胞的机会。目前临床使用的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）靶向RSV F，并常规使用传统病毒中和试验进行评估。然而，这些抗体抑制合胞体形成的能力仍然缺乏表征，因为这些试验主要测量病毒对细胞的进入而非细胞间融合。研究人员在此介绍了一种基于流式细胞术（flow cytometry）的定量检测方法，用于测量RSV感染期间的合胞体形成。利用这一方法，研究团队在HEp-2和A549细胞中对临床相关的抗F单克隆抗体进行了评估，比较了它们在合胞体抑制和传统病毒中和试验中的效力。Palivizumab、nirsevimab和clesrovimab均以剂量依赖方式抑制合胞体形成，但效力差异不大。相比之下，nirsevimab和clesrovimab表现出显著高于palivizumab的病毒中和效力。这些发现表明，抑制RSV诱导的细胞间融合是抗F抗体的一个独特功能特性，不能被传统中和试验完全捕捉。研究人员建立的合胞体抑制检测为评估靶向RSV及其他合胞体形成病毒的抗体提供了一种定量方法，并突显了互补功能读出指标在抗体评估中的价值。

**重要性**

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是导致婴幼儿、老年人和免疫受损人群呼吸道疾病的主要病原体。RSV感染的一个特征是合胞体形成，尽管其在病毒传播和疾病致病机制中的贡献仍未完全明确。融合能力增强与疾病严重程度增加相关，合胞体形成可能促进细胞间传播，同时限制病毒颗粒暴露于细胞外中和抗体。尽管靶向RSV融合（fusion, F）蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）正越来越多地用于疾病预防，其抑制合胞体形成的能力仍未得到探索，因为传统中和试验主要测量病毒对细胞的进入。研究人员在此描述了一种基于流式细胞术（flow cytometry）的定量检测方法，用于测量RSV诱导的合胞体形成，并评估临床相关抗F单克隆抗体的抑制作用。研究结果表明，合胞体抑制代表了一种不能被传统中和试验完全捕捉的抗F抗体独特功能特性，突显了评估靶向RSV及其他合胞体形成病毒的抗体时互补功能读出指标的价值。

**论文解读**

**一、研究背景与问题提出**

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是婴幼儿、免疫受损人群和老年人下呼吸道感染的主要病原体，在全球范围内造成显著的发病率和死亡率。RSV感染的一个显著特征是感染性细胞与相邻未感染细胞之间发生膜融合，形成多核合胞体（syncytium）。这一过程由感染细胞表面表达的RSV融合蛋白（RSV fusion protein, RSV F）介导，该蛋白从亚稳态的融合前构象（prefusion F, pre-F）转变为融合后构象（post-fusion, post-F），从而驱动膜融合。合胞体形成可能促进病毒在细胞间的直接传播，同时减少病毒颗粒暴露于细胞外中和抗体和免疫细胞的机会，从而削弱抗体的抗病毒效果。此外，已有研究表明RSV融合能力增强与疾病严重程度增加相关，凸显了合胞体形成在RSV致病机制中的重要性。

目前临床上使用的抗RSV F单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）包括palivizumab（靶向抗原表位II，在pre-F和post-F上均有表达）、nirsevimab（靶向pre-F上的抗原表位?）和clesrovimab（靶向抗原表位IV，在pre-F和post-F上均有表达）。这些抗体的效力主要使用传统病毒中和试验进行评估，该试验测量的是病毒对细胞的进入，而非细胞间融合过程。因此，这些抗体抑制合胞体形成的能力仍然缺乏系统表征。随着这些mAbs在预防RSV相关疾病中的广泛应用，亟需建立能够评估其合胞体抑制能力的方法，以全面了解其抗病毒活性并指导临床用药决策。

**二、研究人员开展的研究与主要发现**

针对上述问题，研究人员建立了一种基于流式细胞术（flow cytometry）的定量检测方法来测量RSV感染期间的合胞体形成。利用这一方法，研究团队在HEp-2和A549细胞系中系统比较了三种临床相关抗F mAbs在合胞体抑制和传统病毒中和试验中的效力，通过设置不同的抗体添加时间点、检测时间点和感染复数（multiplicity of infection, MOI），全面评估了合胞体抑制的动力学特征和剂量-反应关系。

研究得出以下关键结论：三种mAbs均以剂量依赖方式抑制合胞体形成，且效力差异不大（IC₅₀值差异≤2.5倍）；然而，在传统病毒中和试验中，nirsevimab和clesrovimab表现出显著高于palivizumab的效力（在HEp-2细胞中分别高115倍和28倍，在A549细胞中分别高166倍和29倍）。这些发现表明，抑制RSV诱导的细胞间融合是抗F抗体的一个独特功能特性，不能被传统中和试验完全捕捉。

该研究的重要意义在于：为评估靶向RSV及其他合胞体形成病毒的抗体提供了定量方法学工具，并突显了将合胞体抑制作为互补功能读出指标纳入抗体评估和临床决策的必要性，这对全面理解抗F mAbs的抗病毒活性和优化预防策略具有重要意义。

**三、主要技术方法**

研究人员主要采用以下关键技术方法：（1）基于流式细胞术的合胞体定量检测：利用慢病毒载体（lentiviral vector）将mCherry和tagBFP荧光报告基因稳定导入HEp-2和A549细胞系，通过检测双阳性（mCherry⁺、tagBFP⁺）细胞群体来定量合胞体形成。（2）重组绿色RSV（recombinant green RSV, rgRSV）感染模型：使用rgRSV感染共培养细胞，在感染后不同时间点通过流式细胞术同时定量合胞体形成和感染水平（GFP⁺细胞）。（3）延迟抗体添加策略：通过在感染后8小时（8 hpi）添加mAbs，在保留首轮感染的同时评估合胞体抑制效果。（4）剂量-反应曲线拟合与IC₅₀计算：使用四参数logistic回归模型拟合剂量-反应曲线，计算半数抑制浓度（50% inhibitory concentration, IC₅₀），比较合胞体抑制和病毒中和的效价差异。研究使用的细胞系来源于公共细胞库，包括HEp-2（人喉癌上皮细胞）和A549（人肺泡上皮细胞）。

**四、研究结果**

**（1）定量流式细胞术检测方法的建立与优化**

通过概念验证实验，研究人员在A549细胞中证实rgRSV（MOI=3）感染后46小时（46 hpi）双阳性细胞比例为13.5%，而对照组仅为0.4%，与显微镜观察结果一致，验证了该检测方法的可靠性。通过延迟mAb添加时间（0、2、4、8 hpi），研究人员确定在8 hpi添加mAbs可最大程度保留首轮感染水平（与无mAb对照相似），同时有效抑制合胞体形成。三种mAbs在所有添加时间点均显示出相似的合胞体抑制效果，表明合胞体抑制在较宽的干预时间窗口内均保持有效。

**（2）合胞体形成的时间动力学与持续抑制**

动力学研究表明，HEp-2和A549细胞中合胞体形成随时间增加，HEp-2细胞在46 hpi达到约15%双阳性细胞，A549细胞在22至30 hpi达到约11%峰值。在8 hpi添加mAbs后，三种mAbs在所有检测时间点（22、30、46 hpi）均持续抑制合胞体形成，且首轮感染水平不受影响。长期显微镜观察显示，palivizumab可抑制合胞体形成长达感染后8天（8 dpi），同时RSV感染细胞在palivizumab处理组中仍可检测到，表明合胞体抑制并不完全消除病毒感染，而是限制细胞间传播。

**（3）合胞体抑制与病毒中和的效价差异**

剂量-反应实验显示，三种mAbs均以剂量依赖方式抑制合胞体形成，拟合曲线高度重叠，nirsevimab仅有轻微左移。相比之下，传统病毒中和试验（mAbs在0 hpi与病毒同时添加）显示出明显的效价差异：nirsevimab和clesrovimab在HEp-2细胞中分别比palivizumab效力高115倍和28倍，在A549细胞中分别高166倍和29倍。Palivizumab是唯一在两种试验中IC₅₀值相似的mAbs，说明其抗原表位II在两种功能场景中具有相似的可及性，而靶向pre-F特异性表位的抗体在合胞体抑制中未能发挥其中和效价优势。

**五、讨论与结论**

研究讨论指出，合胞体抑制代表了一种与传统病毒中和相关但不同的抗病毒功能。抗体抑制合胞体形成的能力此前已有报道，但本研究在感染模型中系统比较了三种临床相关mAbs的合胞体抑制和中和效力，为理解不同表位抗体功能差异提供了新视角。讨论认为，合胞体形成过程中RSV F呈现的抗原景观与细胞外病毒颗粒中和过程中不同，包括感染细胞表面、出芽病毒颗粒、病毒丝状结构和释放的病毒颗粒等多种构象，这种异质性可能导致中和效价不能直接转化为合胞体抑制效力。丝状RSV颗粒中糖蛋白的致密排列可能降低某些表位的抗体可及性，而初级感染和合胞体形成可能分别由球形和丝状颗粒驱动，这进一步解释了两种功能读出指标之间的差异。

讨论还指出了该检测方法的局限性：双阳性细胞检测可能低估总融合事件，因为相同荧光蛋白标记的细胞之间的融合无法检测；不同细胞系（HEp-2 vs A549）和不同RSV毒株可能影响合胞体形成的动态范围；体外细胞模型不能完全模拟体内合胞体形成的病理环境。然而，RSV F介导的细胞间融合过程在不同系统中是保守的，因此所观察到的抗体相对活性差异可能仍具有参考价值。

**研究结论：**抑制RSV诱导的细胞间融合是抗F抗体的一个独特功能特性，不能被传统中和试验完全捕捉。将合胞体抑制作为互补功能读出指标纳入抗体评估，可更全面地评价靶向RSV F及其他参与合胞体形成病毒蛋白的抗体。这一流式细胞术定量方法不仅适用于RSV抗体评估，也可推广至麻疹病毒、尼帕病毒等其他合胞体形成病毒的抗体功能评价，为抗病毒抗体药物的研发和临床评估提供了新的工具视角。