《Diversity》：Expanding the Known Diversity of the Truffle Genus Genea: One New Species and Two New Records from Hungary
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块菌属Genea作为外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungus, EM），其全球范围内的分类学、进化关系及生态行为研究仍较为匮乏。研究人员基于形态学观察及内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）与核rDN
块菌属Genea作为外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungus, EM），其全球范围内的分类学、进化关系及生态行为研究仍较为匮乏。研究人员基于形态学观察及内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）与核rDNA大亚基（large subunit, LSU）序列的系统发育分析，描述了新种Genea budensis sp. nov.，并报道了G. arenaria和G. zamorana在匈牙利的首次分布记录。新种Genea budensis发现于匈牙利布达山（Buda Mountains），其特征为具疣状、鳞片覆盖的包被（peridium）；孢子表面密布锥形饰物（ornamentation），其中部分呈钝头或芽殖状。这些发现扩展了Genea属在匈牙利的已知物种多样性与地理分布，并为该属未来的分类学研究补充了形态学与分子数据。
1. 引言
Genea Vittad.是一类重要的地下生囊菌（hypogeous ascomycetes），作为外生菌根真菌（ectomycorrhizal fungus, EM），该属真菌不仅能定殖于外生菌根（EM）根系，还在长期进化中形成了抵御恶劣环境的生态策略。自该属由Carlo Vittadini首次建立并献给意大利动物学家Carlo Giuseppe Gené以来，其分类框架经历了多次调整：早期被Trappe归入Geneaceae，随后基于形态与分子数据的重新评估被置于Pyronemataceae内。尽管Species Fungorum目前承认该属有49个有效种，而Index Fungorum与MycoBank因收录异名、亚种名及归并至Genabea、Hydnocystis等属的名称而记录了更多名称，但关于Genea的全球分类学、系统发育关系及生态行为仍未得到充分认知。对于这一形态趋同现象突出的隐蔽真菌类群，ITS与核rDNA大亚基（large subunit, LSU）序列已被证明是解析种级系统发育关系的核心分子标记，而孢子长度、宽度、纹饰大小以及包被与子实层结构等形态参数同样对物种界定至关重要。喀尔巴阡-潘农地区（Carpatho-Pannonian region）作为生物多样性热点区域，此前研究人员在该地区发现了Genea szemerei新种，并首次报道了G. pinicola在匈牙利的分布。为持续推进该区域的分类学修订，研究人员在持续野外调查的基础上，对既往采集及馆藏标本开展了形态学与分子数据的整合研究。
2. 材料与方法
研究人员在匈牙利及喀尔巴阡-潘农地区采集并核查了Genea属标本，新种Genea budensis sp. nov.的正模标本（holotype）保存于匈牙利自然历史博物馆（Magyar Természettudományi Múzeum），编号为HNHM-MYC 075478（凭证号113790）。形态学观察依据《真菌鉴定手册》的标准术语进行，颜色评估采用爱丁堡皇家植物园标准比色卡，显微特征借助Nikon Optiphot 2研究显微镜及Thermo Fisher Scientific Apreo C扫描电子显微镜（scanning electron microscope, SEM）进行观察与摄影，孢子尺寸使用Piximétre Version 6.1 R 560程序测量。为检验新种与近缘类群的形态边界，研究人员随机选取30个孢子，对七种主要Genea类群的孢子长度、宽度及纹饰大小进行比较，并采用Welch's ANOVA及Dunnett's T3 post hoc检验进行统计分析。分子系统学方面，研究以Humaria hemisphaerica和H. cazaresii为外群，选取涵盖Genea属各类群的ITS与LSU序列构建数据集，使用PRANK软件进行多序列比对；由于单一基因座分析未产生拓扑冲突，研究人员将ITS与LSU比对结果连接（concatenated）并划分为三个分区，其中5.8s rDNA与ITS1–ITS2作为独立分区，LSU作为第三分区，缺失数据按缺失处理。系统发育推断通过RAxML-NG以最大似然法（maximum likelihood, ML）构建树形结构，并进行1000次重复的自举分析（bootstrap, BS）；同时使用MrBayes进行贝叶斯推断（Bayesian inference, BI），运行5 × 10
6代，四条马尔可夫链，每1000代采样一次，烧弃比例（burn-in）为0.25，模型选择由ModelTest-NG完成。物种界定分析则采用多速率泊松树过程（multi-rate Poisson Tree Processes, mPTP）与单速率泊松树过程（single-rate Poisson Tree Processes, PTP）方法。
3. 结果
3.1 系统发育分析
联合ITS与LSU序列的系统发育分析包含91个Genea物种。结果显示，新种Genea budensis sp. nov.形成一个具有强支持度的单系群（BS: 100; BPP: 1.00），与G. fragrans支系互为姐妹群，二者间的枝长分化显著；在更宏观的系统尺度上，G. budensis也与G. pseudoverrucosa构成姐妹关系。BLASTn比对表明，G. budensis的ITS序列与G. verrucosa相似度最高（99.58%，query coverage 99–100%），LSU序列则与G. fragrans最接近（98.33%，coverage 97%）。序列一致性分析显示，没有任何G. budensis序列与G. fragrans的相似度超过93.4%，而种内序列相似度均不低于95.3%。此外，mPTP与PTP分析均支持G. budensis为独立进化谱系，并与G. fragrans互为单系分离；原先被鉴定为G. fragrans的两个序列（AH_44125、AH_44127）实际落在G. budensis簇内，提示既往存在未解析的物种边界。关于新记录种，ZB 6074号标本与G. zamorana的模式标本以高支持度聚类（BS: 100; BPP: 1.00），BLASTn显示其与模式序列的相似度为96.27%（query coverage 99%）；ZB 3324号标本则以全支持度（BS: 100%; BPP: 1.00）嵌套于G. arenaria支系内，ITS序列与已知凭证序列AH44101的相似度为97.67%。
3.2 形态学与统计学比较
Genea budensis sp. nov.的子囊果（ascomata）呈黑色、近球形至不规则裂瓣状，直径5–8 mm，表面覆有多边形疣状鳞片，基部具菌丝束；包被（peridium）单层，厚约142 μm，由深色角状细胞与近球形透明细胞构成；子囊孢子（ascospores）宽椭圆形，大小为(30.9–)31.8–35.9(–38.4) × (25.8–)26.4–30.3(–33.2) μm（Qav = 1.2, n = 30），表面密布3.6–5 μm高的钝顶锥形或芽状饰物。统计分析表明，G. budensis的孢子长度显著小于近缘种G. fragrans（33.85 vs. 38.33 μm, p < 0.0001），宽度也更窄（28.37 vs. 30.52 μm, p = 0.0092），且效应量均超过0.8的大效应阈值。G. szemerei与G. pseudobalsleyi在孢子长度上存在显著差异（25.55 vs. 28.40 μm, p < 0.0001），但二者孢子宽度无统计学差异（p = 0.8556），说明孢子尺寸 alone 可能不足以区分所有物种。
Genea zamorana的新记录标本（ZB 6074）子囊果黑色至棕褐色，表面具0.7–1 mm多边形疣；包被双层，厚103–170 μm；子囊圆柱形，含6–8个单行孢子；孢子近球形至卵圆形，具截顶锥形或近乎立方体状疣。系统发育分析显示其与西班牙模式标本（AH 49255）以全支持度聚类，并与G. balsleyi、G. pseudobalsleyi及G. szemerei构成的支系互为姐妹群。形态测量与原始描述基本一致，差异仅在于该标本缺乏外层假薄壁组织（pseudoparenchyma）层与内层假组织（prosenchyma）层之间明显的红色内含物。
Genea arenaria的新记录标本（ZB 3324）具棕色、裂瓣状子囊果，表面覆有菌丝束；包被单层，厚100–148 μm，疣状突起250–300 μm；子囊圆柱形，含8个单行孢子，渐狭为狭窄、弯曲、透明的子囊柄；孢子宽椭圆形，具砧状或叉状钝顶疣，高1.7–2.3 μm，宽约2 μm。分子数据支持其归入G. arenaria支系，ITS序列与AH 44102、AH 44104的相似度分别为99.7%与99.2%，与最近缘其他物种的相似度不超过95.4%。形态上，该标本区别于原始描述之处在于缺乏包被刚毛，且 consistently 观察到狭窄、弯曲、透明的子囊柄。
4. 分类学
Genea budensis S. Chakraborty & Z. Bratek, sp. nov.（MB865637）
该种以发现地匈牙利布达山命名，于Carpino-Quercetum林下的棕色森林土壤中采集，与块菌（Tuber aestivum）同域生长。其主要鉴别特征为：子囊果黑色、鳞片状、多边形/锥状疣被覆；单层包被厚约142 μm；子囊孢子直径多大于30 μm且小于38 μm，表面覆有密集的钝顶锥形、有时芽状的饰物，高3.6–5 μm。系统发育分析显示该种为G. fragrans支系内的独立物种。尽管G. szemerei、G. fageticola与G. pseudobalsleyi在形态上与G. budensis相似，但系统发育分析表明它们并非近缘种。与G. fageticola的区别在于后者包被为双层（200–400 μm），且孢子更宽（Qav 1.41）；与G. pseudoverrucosa的区别在于后者孢子更大且饰纹更宽（3–4.5 μm），腔室为均一迷宫状；与G. pseudobalsleyi的区别在于孢子形态及指状、截顶疣饰。
Genea arenaria Harkn., Proc. Calif. Acad. Sci. 1 (8): 263 (1899)
该种依据ZB 3324号标本确立其在匈牙利的分布。其形态特征包括裂瓣状、近球形子囊果，具不规则至圆形腔室及顶孔；单层包被厚100–148 μm；子实层白色至浅黄褐色；子囊圆柱形，含8个单行孢子；孢子宽椭圆形，具砧状或叉状钝顶疣。形态与原始描述基本一致，但 consistently 观察到狭窄、弯曲、透明的子囊柄，且缺乏包被刚毛；该特征组合可与G. hispidula（包被密被刚毛）及G. compacta（孢子更大、饰纹更密）相区分。
Genea zamorana Cabero, P. Alvarado & B. Martín, Persoonia 47: 315 (2021)
该种依据ZB 6074号标本确立其在匈牙利的首次记录。其子囊果黑色至棕褐色，表面具多边形疣；包被双层；内褶叠的子实层腔室由栅栏状排列的白色子实层构成；子囊圆柱形，含6–8个单行孢子；孢子近球形至卵圆形，具截顶锥形或近乎立方体状疣。系统发育分析显示其与西班牙模式标本以全支持度聚类。形态测量与原始描述基本一致，但缺少外层假薄壁组织（pseudoparenchyma）层与内层假组织（prosenchyma）层之间明显的红色内含物。
5. 讨论
研究指出，Genea budensis sp. nov.因其遗传一致性、ITS无种内变异，以及与近缘种G. fragrans在腔室结构、孢子大小与纹饰上的显著差异，构成G. fragrans支系内的独立进化谱系。尽管G. verrucosa因缺乏模式谱系且形态描述多变而难以界定，但G. budensis并非此类争议对象。研究人员采用Welch's ANOVA及Dunnett's T3 post hoc检验，旨在建立可靠的物种诊断孢子尺寸范围并强化以孢子尺寸作为一级分类性状的概念；结果显示G. fragrans拥有数据集中最大的孢子，而G. budensis的孢子显著更短更窄，且效应量均高于0.8的大效应阈值。研究强调，形态学上反复出现的孢子纹饰趋同现象意味着Genea属的物种界定必须依赖整合分类学（integrative taxonomy）方法，单一形态或分子特征均可能导致误判。G. zamorana与G. arenaria的匈牙利首次记录证实了该属在欧洲的广泛分布；G. arenaria新记录标本的ITS变异（约97–100%）高于Genea属内其他部分物种，且其系统发育嵌套关系与形态的原始描述基本吻合。综上所述，Genea budensis sp. nov.是一个由DNA序列、孢子大小及纹饰共同支持的明确谱系；G. zamorana与G. arenaria的新记录扩展了二者的已知分布范围；而该属内反复出现的孢子形态趋同凸显了在Genea这类疑难属中采用多特征整合方法解决物种边界问题的必要性，尤其对于如G. lespiaultii/sphaerica clade这类仅以饰纹长度区分的类群，未来需引入更多遗传标记以严格界定物种边界。
