整合转录组学和计算机模拟分析发现了与弥漫大B细胞淋巴瘤中的BCL6和SPARC相关的新长链非编码RNA

《Computational Biology and Chemistry》：Integrative Transcriptomic and In Silico Analysis Identifies Novel Long Non-Coding RNAs Associated with BCL6 and SPARC in Diffuse Large B-Cell Lymphoma

•整合了SRA和TCGA的RNA-seq数据集，以研究DLBCL中的转录组变化。•结合队列特异性的DESeq2分析，描述了差异性转录表达。•样本级别的TPM比较发现了表达失调一致的转录本。•主成分分析和热图揭示了全局和候选转录本的表达模式。•相关性分析考察了候选lncRNAs与其配对mRNAs之间的关联。•差异相关性分析评估了正常样本和肿瘤样本之间lncRNA–mRNA关联的变化。•IntaRNA预测了候选lncRNAs与mRNAs之间的潜在相互作用。•CatRAPID使用一个包含723个DLBCL相关蛋白的定制面板评估潜在的相互作用。•突变分析研究了候选基因中的基因组变化。•生存分析评估了候选lncRNAs的潜在预后相关性。•半定量PCR和扩增子测序确认了选定的lncRNA转录本。•综合计算和实验分析为未来的功能研究提供了假设。•整合的SRA和TCGA转录组学数据确定了DLBCL中的三个候选lncRNAs。•半定量PCR验证了lnc-SPARC-2:3、lnc-FXYD2-1:5和lnc-ADAMTS1-2:1。•IntaRNA预测了RNA–RNA相互作用，并通过跨队列相关性分析得到了支持。•CatRAPID预测了候选lncRNAs与BCL6之间的潜在相互作用。•相关性分析发现了三个lncRNA–mRNA对之间的正相关关系。•ECM蛋白聚糖富集和SPARC上调表明了基质重塑。•生存分析显示lnc-FXYD2-1:5没有显著的预后趋势。•综合分析为未来的功能和治疗方法研究提供了候选对象。

引言
首次系统性地分析弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中的新型长链非编码RNA（lncRNAs）发现了2,632个新的lncRNA表达，其中三分之二在正常B细胞中未表达（Verma et al., 2015）。2016年，另一项研究表明，六个lncRNAs（SACS-AS1、MME-AS1、CSMD2-AS1、RP11-360F5.1、RP11-25K19.1、CTC-467M3.1）根据生存分析与104名患者的高风险和103名患者的低风险相关（Sun et al., 2016）。多项研究表明，一些lncRNAs在DLBCL中表达失调且具有功能相关性。HOTAIR在肿瘤组织和细胞系中持续过表达，与不良预后相关，并通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路促进增殖，在敲低后会诱导G2/M期停滞和凋亡（Yan et al., 2016）。对天真B细胞、记忆B细胞和生发中心B细胞的转录组分析发现FLJ42351、LINC00116和LINC00461在DLBCL中显著上调，其肿瘤细胞特异性表达和主要核定位提示其具有顺式调控作用（Tayari et al., 2016）。LUNAR1在肿瘤样本中过表达，并与E2F1、Cyclin-D1和p21呈正相关，其耗竭可抑制细胞生长（Peng and Feng, 2016）。HULC在患者和细胞系中显著升高，其沉默可抑制增殖并与其他不良预后相关（Peng et al., 2016a）。MALAT-1的表达与淋巴结转移相关，并通过调节自噬相关蛋白增强化疗敏感性（Wang et al., 2016, Li et al., 2017）。一种工程化的i-lncRNA旨在结合多种致癌miRNAs，通过恢复肿瘤抑制靶点显著降低细胞活力并诱导凋亡（Su et al., 2016）。PEG10在肿瘤和细胞系中强烈上调，预测整体生存率较低，其敲低会引发广泛凋亡（Peng et al., 2016b）。综合分析进一步揭示了与免疫相关过程相关的亚型特异性lncRNAs，区分了GCB和ABC亚型（Zhou et al., 2017）。相反，lncRNA-p21在DLBCL中下调，其过表达通过抑制Cyclin-D1和CDK4来抑制增殖（Peng et al., 2017）。基于微阵列的研究还发现了多个失调的转录本，包括与数百个基因共表达的八个验证候选基因（Gao et al., 2017），而大规模芯片分析检测到淋巴瘤细胞系和正常B细胞之间有超过一千个差异表达的lncRNAs（Zhu et al., 2017）。NONHSAG026900在肿瘤中减少，并与细胞周期进展的抑制相关（Zhao et al., 2017）。PANDA也具有肿瘤抑制功能，其表达减少与不良预后和MAPK/ERK通路抑制丧失相关（Wang et al., 2017），GAS5也表现出频繁的基因组变化和RNA失调，支持其作为DLBCL生物标志物的潜力（Dousti et al., 2018）。相比之下，几种致癌lncRNAs升高，包括NEAT1，它促进增殖和迁移并预测不良预后（Deng et al., 2018）。FIRRE是一种这样的lncRNA，它促进生长并抑制凋亡（Shi et al., 2019）。其他调控轴还包括SMAD5-AS1，它下调并通过miR-135b-5p调节增殖（Zhao et al., 2019a）。TUG1与MET相互作用并支持肿瘤生长（Cheng et al., 2019）。SNHG14通过miRNA介导的反馈回路驱动进展和免疫逃逸（Zhao et al., 2019b），而OR3A4的敲低可以抑制增殖和Wnt/β-catenin信号通路（Meng et al., 2020）。PEG10通过结合miR-101-3p促进KIF2A表达（Zhao et al., 2020）。NEAT1还通过miR-34b-5p–GLI1通路调节增殖（Qian et al., 2020），AFAP1-AS1是GCB-DLBCL中最过表达的转录本之一，与较差的无病生存率和总体生存率相关（Gao et al., 2020）。循环血浆中的HOTAIR、XIST和GAS5已成为能够区分患者和治疗反应者的非侵入性生物标志物（Senousy et al., 2021）。最近，ARRDC1-AS1被证明通过miR-2355-5p/ATG5轴促进自噬和肿瘤进展（Xu et al., 2021）。SNHG8通过结合miR-335-5p增强增殖（Yu et al., 2021），而PCAT1作为竞争性内源性RNA调节miR-508-3p/NFIB信号通路，驱动肿瘤侵袭性（Tian et al., 2021）。

在DLBCL和滤泡性淋巴瘤中，BCL6经常通过染色体易位、启动子突变或构成性表达失调，导致持续增殖、分化受阻和肿瘤细胞存活增强；高水平的BCL6表达是生发中心样DLBCL亚型的特征，并与治疗耐药性相关（Liongue et al., 2024, Wagner et al., 2011）。BCL6是一种保守的锌指转录抑制因子，对生发中心的形成和多种免疫细胞谱系的调节至关重要，包括GC B细胞和T滤泡辅助细胞，它控制转录、染色质重塑、细胞周期进展和DNA损伤反应通路（Polo et al., 2007, Ci et al., 2008）。在生理条件下，BCL6限制致癌信号并维持生发中心反应期间的受控增殖，但其失调会破坏这种平衡并促进肿瘤发生（Ci et al., 2009）。SPARC，以前称为Secreted Protein Acidic and Rich in Cysteine，也称为骨连接蛋白或BM-40，是一种具有多种生物功能的基质细胞糖蛋白。它在调节细胞与细胞外基质的相互作用中起关键作用，从而影响组织组织和重塑，以及控制基本细胞过程，包括黏附、生长、迁移和分化（Bradshaw and Sage, 2001）。在SPARC缺失的小鼠中，B系祖细胞池（pro-B、pre-B和未成熟B细胞）和原始造血细胞群（LSK和LTC细胞）的总体大小减少，而多能祖细胞群（CFU-S12）扩大。这些发现表明SPARC是早期B淋巴细胞生成的关键调节因子（Wagner et al., 2011）。

尽管对癌症中的长链非编码RNA（lncRNAs）的兴趣日益增加，但迄今为止尚未明确鉴定出DLBCL特异性的lncRNAs，大多数之前报道的涉及弥漫大B细胞淋巴瘤的lncRNAs都是已从其他恶性肿瘤或生物系统中知晓的广泛研究的转录本。这突显了识别淋巴瘤特异性非编码调控因子的关键缺口。本研究揭示了三种新的lncRNAs的调控作用，即lnc-ADAMTS1-2:1、lnc-FXYD2-1:5和lnc-SPARC-2:3。这些lncRNAs与BCL6蛋白有强烈的相互作用倾向，尤其是lnc-SPARC-2:3和SPARC，表明它们可能在DLBCL中协调破坏生发中心调控机制和B细胞谱系分化中起调控作用，其特征是BCL6减弱和SPARC过表达。为了进一步支持这些预测的相互作用，在SRA和TCGA队列中进行了lncRNA–mRNA表达相关性和差异关联分析，以评估这些关系的一致性和在调整队列和基质评分后的稳健性。这些发现为lncRNA介导的调控机制提供了新的见解，并突出了DLBCL中的潜在生物标志物和治疗靶点。

### 转录组数据检索和生物信息学流程
我们的研究使用了从Sequence Read Archive（SRA）获取的原始RNA测序数据集，访问号为SRP021509（对应正常样本）和SRP100394（对应肿瘤样本），以及从Genomic Data Commons（GDC）门户下载的受控访问TCGA-DLBCL数据。FASTQ文件从SRA存储库下载，并使用FastQC（Andrews, 2010）进行了初步质量评估。修剪了低质量碱基和接头序列。

### 基因筛选和差异表达分析
主成分分析（PCA）显示正常样本和肿瘤样本之间有明显的分离，表明mRNA谱型不同。PC1和PC2分别解释了43%和11%的总方差，肿瘤样本的离散度大于正常样本（图2a）。由于TCGA和SRA数据集合并用于后续分析，因此也分别对每个数据集进行了PCA，确认了mRNA表达谱型的明显分离。

### 讨论
原始测序数据使用FastQC进行了质量检查，使用HISAT2对齐到hg38参考基因组，并使用SAMtools处理以生成BAM文件。使用BEDTools获得转录本级别的读数计数，然后使用DESeq2进行差异表达分析，以识别肿瘤样本和正常样本之间显著改变的mRNAs和lncRNAs（图1）。PCA在合并的SRA–TCGA数据集中显示正常样本和肿瘤样本的mRNA和lncRNA谱型有明显的分离。

### 结论
本研究描述了弥漫大B细胞淋巴瘤中的全转录组重编程景观，表明淋巴瘤的发生主要是由协调的转录和转录后失调驱动，而不是重复的编码突变。系统筛选和实验验证确定了一组高置信度的顺式关联lncRNAs，即lnc-SPARC-2:3、lnc-FXYD2-1:5和lnc-ADAMTS1-2:1。这些lncRNAs在所有样本中一致表达。

### 资金
该项目没有接受任何特定资助。

### 作者贡献声明
Neerkaje Subrayabhat Devaki：撰写 – 审查与编辑、资源、项目管理、调查、数据净化、概念化。
Sathees C Raghavan：撰写 – 审查与编辑、监督、资源、方法论、调查、概念化。
Bibha Choudhary：监督、资源、方法论、数据净化、概念化。
Sagar Desai：可视化、验证、数据净化。
Urbi Roy：撰写 – 审查与编辑、可视化、验证、数据净化。

### 生成AI和AI辅助技术在写作过程中的声明
我们使用ChatGPT 5.2和5.6 Luna来改进和重述手稿中的选定句子，以提高清晰度和简洁性。所有AI辅助的文本输出都经过了仔细审查和必要的编辑，并核实了科学准确性和与研究结果的一致性。生成AI工具也被用于准备选定的视觉元素。图1中的RNA-seq流程图流程图使用的代表性图标是使用Nanobanana生成的。

### 利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响或被认为可能影响本文的工作。