化学工具捕获核小体底物上的组蛋白修饰酶用于结构生物学研究

《Current Opinion in Chemical Biology》：Chemical tools for trapping histone modification enzymes on nucleosome substrates for structural studies

　　

组蛋白翻译后修饰（PTMs）通过调控蛋白质招募和染色质结构调节，充当基因组的守门人。负责添加和去除组蛋白PTMs的酶功能失调常见于多种疾病状态，因此组蛋白修饰酶正成为重要的治疗靶点。鉴于此，阐明组蛋白修饰酶在生理性核小体底物上发挥功能的分子机制一直是优先研究方向。然而，由于许多酶与核小体的相互作用具有固有的低亲和力和瞬时性，结构研究仍具挑战性。过去十年间，越来越多的化学生物学工具被报道，用于捕获正在核小体上作用的组蛋白修饰酶以进行结构生物学研究。研究人员借此机会综述了这些策略，并强调了它们为染色质生物学带来的最新进展。

论文解读文章

研究背景与科学问题

组蛋白翻译后修饰（PTMs）通过调控蛋白质招募和染色质结构动态变化，在基因组功能调控中发挥核心作用。催化PTMs添加与去除的组蛋白修饰酶在癌症等多种疾病中广泛失调，已成为重要的药物靶点。早期研究多聚焦于酶催化结构域与短肽底物的复合物结构，但后续发现组蛋白修饰酶的特异性来源于与完整核小体的多价相互作用，这种作用远超其PTM位点周围的氨基酸序列。因此，在更接近生理条件的核小体底物上进行结构研究成为迫切需求。然而，酶与核小体的结合通常具有低亲和力、瞬时性和构象动态性等特征，使得传统结构解析技术面临巨大困难。特别是冷冻电镜（cryo-EM）需要对数十万至数百万张单颗粒图像进行平均，组成异质性和构象异质性成为主要障碍。此外，许多组蛋白修饰酶可靶向同一组蛋白上的多个不同位点，进一步增加了结构分析的复杂性。

研究方法与技术路线

为克服上述挑战，研究人员开发了四类稳定酶-核小体复合物的策略：1）遗传融合；2）高亲和力底物类似物；3）预形成或酶催化的双底物抑制剂；4）共价过渡态复合物。这些方法充分利用了核心组蛋白的两个特性：一是半胱氨酸残基相对稀少，可通过烷基化选择性引入化学修饰；二是组蛋白尺寸小且PTMs多位于末端区域，使其成为表达蛋白连接（EPL）、分选酶介导的连接和蛋白质反式剪接等半合成技术的理想对象。

研究结果

赖氨酸甲基转移酶和去甲基化酶

对于赖氨酸甲基转移酶（KMTs），最简便的策略是遗传性赖氨酸-to-甲硫氨酸（K-to-M）突变。例如，利用H3K36M突变核小体成功解析了Set2和SETD2的结构，而野生型核小体无法获得清晰的酶密度。正亮氨酸（Nle）替代策略同样有效，尤其在非SET家族KMT——DOT1L的研究中，H3K79Nle突变使研究人员捕获到活性态构象，观察到催化结构域25 ?的大幅位移，分辨率显著高于未激活态结构。S-乙基半胱氨酸（Ecx）通过溴乙烷烷基化半胱氨酸突变体引入，对SET8的研究显示其结合亲和力优于K20M突变。

对于赖氨酸去甲基化酶（KDMs），多数结构依赖双底物抑制剂。FAD依赖性胺氧化酶LSD1/2采用N-甲基炔丙基-赖氨酸策略，该修饰能与FAD辅因子形成共价加合物。JmjC家族则使用UNC8015化合物与H3K36C突变体烷基化形成的双底物抑制剂，成功解析了KDM2A、KDM2B和KDM6B的核小体复合物结构。有趣的是，KDM6B识别紧密包裹的核小体DNA连接子，这与KDM2和SETD2作用于瞬时解旋核小体的模式截然不同。

赖氨酸乙酰转移酶和去乙酰化酶

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）方面，预形成的Lys-CoA双底物抑制剂是关键工具。通过表达蛋白连接制备的全长H4K16-CoA蛋白，使研究人员得以解析MYST家族KAT——NuA4复合物与核小体的冷冻电镜结构。类似的策略也应用于MSL复合物，揭示了多价相互作用如何引导H4 N端尾进入活性位点以实现H4K16特异性。

对于NAD⁺依赖性去乙酰化酶（Sirtuins），取代硫脲修饰的赖氨酸（如甲基硫脲MTU）能在酶催化下形成稳定的ADP-核糖中间体。利用分选酶连接制备的H3K9MTU核小体，研究人员解析了SIRT6-核小体复合物，发现SIRT6通过内部环区结合H2A-H2B酸性斑块、H2A C端尾和核小体DNA，末端15 bp DNA解离并与H3 N端尾相互作用。比较SIRT6在H3K9和H3K27两个位点的结构，揭示催化结构域旋转25°以及额外DNA解旋是实现多位点脱乙酰化的分子基础。SIRT7的研究则展示了酸性斑块锚定结合完全包裹核小体的模式，且K36和K18位点间存在构象重排。

泛素连接酶和去泛素化酶

针对E3泛素连接酶，研究人员开发了一系列共价捕获策略。最简单的方法是利用双马来酰亚胺乙烷（BMOE）交联E2活性位点半胱氨酸和组蛋白半胱氨酸突变体，成功用于解析APC/C与组蛋白复合物的结构。更精密的工具包包含三种半合成方法：E2-Ub-核小体共价复合物、分裂内含肽介导的共价复合物（SICC）和基于活性的共价复合物（ACC）。这些方法均使用三功能分子CAET-SAcm共价连接泛素C端、E2活性位点半胱氨酸和组蛋白K-to-C突变体。利用这些工具，研究人员分别解析了RING1B/BMI、BRCA1/BARD1、RNF20/40-RAD6以及RNF168介导的单泛素化和双单泛素化状态的结构。特别值得注意的是，RNF168的双单泛素化结构中，一个泛素占据经典RING E3闭合位置，另一个位于E2对面靠近核小体DNA SHL 3.5的位置。

对于去泛素化酶（DUBs），ACC策略被改造用于捕获BAP1-ASXL1复合物与H2AK119泛素化核小体的结构。该方法预先制备含有活化巯基的核小体-泛素偶联物，当DUB复合物结合核小体时与BAP1活性位点半胱氨酸反应形成共价键。

总结与展望

尽管并非所有组蛋白修饰酶-核小体结构都必须依赖化学工具，但这些策略在以下方面发挥了不可替代的作用：获取新酶类的结构、最大化修饰位点的局部分辨率、以及可视化酶在多位置作用的复杂机制。快速发展的化学生物学工具箱涵盖了从简单的遗传操作到高度复杂的半合成方法等多种手段，其中低门槛的选项（如遗传突变或半胱氨酸烷基化）无需深厚的蛋白质化学专业知识即可广泛应用。目前，类泛素化修饰和精氨酸甲基化有望直接从现有技术中受益，而磷酸化、单胺化和糖基化等修饰则需要全新的技术开发。展望未来，随着染色质结构生物学向多酶协同和多核小体底物研究推进，化学生物学工具将变得越来越重要，并有望实现对复杂混合物中内源性天然酶的捕获。