现代糖缀合物疫苗的理性设计：合成聚糖、位点选择性缀合与新型载体系统的整合进展

《Current Opinion in Chemical Biology》：Advancing modern glycoconjugate vaccines: From synthetic glycans to novel conjugation approaches and carrier systems

　　

糖缀合物疫苗（glycoconjugate vaccines）通过细菌表面多糖与蛋白质载体的共价连接而获得，已彻底改变了b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和伤寒沙门氏菌所致侵袭性感染的预防。这类疫苗将T细胞非依赖性（T-independent）多糖转化为T细胞依赖性（T-dependent）抗原，可诱导长效、可加强的Ig^G（免疫球蛋白G）应答，并为婴幼儿提供有效保护。

已上市缀合物疫苗通常采用随机偶联方式，将天然或经尺寸减小的细菌源荚膜多糖（CPS）连接至破伤风类毒素（TT）、白喉类毒素（DT）或CRM197等类毒素载体上丰富的赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基。

目前亟需拓宽可用疫苗种类，以应对新出现的血清型。此外，抗菌素耐药性的上升凸显了开发靶向当前未满足病原体新疫苗的紧迫性。

缀合物疫苗的免疫原性源于聚糖与蛋白质组分共同贡献的多变量互作，包括聚糖类型及其取代模式、糖与蛋白比例、缀合化学/连接子、蛋白质载体性质及尺寸等。因此，多年来无法确定精确连接位点如何影响免疫应答。过去十年间，多种能够控制糖缀合物疫苗生产中多个因素的技术相继涌现。

碳水化合物化学的巨大进展使得可递送具有明确长度与组成的聚糖，为构建结构-免疫原性关系提供了更清晰的体系。基于化学或糖工程（glycoengineering）方法的位点选择性策略已经建立，并产生了进入临床开发的候选疫苗。此外，新型纳米尺寸载体系统已被用于塑造糖缀合物的免疫应答。

本综述审视了该领域最相关的近期进展，重点介绍过去两年的成果，以阐释现代方法如何用于改进现有疫苗。

糖缀合物疫苗（glycoconjugate vaccines）通过将细菌表面多糖共价连接至蛋白质载体，成功将T细胞非依赖性抗原转化为T细胞依赖性抗原，在预防b型流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和伤寒沙门氏菌等侵袭性感染中发挥了革命性作用。然而，已上市的缀合物疫苗多依赖天然或尺寸减小的荚膜多糖（capsular polysaccharides, CPS）与类毒素载体（如破伤风类毒素（tetanus toxoid, TT）、白喉类毒素（diphtheria toxoid, DT）及CRM197）上丰富氨基酸残基（赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸）的随机偶联，导致产物具有高度异质性。由于免疫原性受聚糖类型、取代模式、糖蛋白比例、缀合化学、连接子及载体特性等多变量共同影响，研究人员长期难以明确精确连接位点对免疫应答的作用。同时，新发病原体的出现与抗菌素耐药性的上升，要求不断扩展疫苗谱系并开发靶向当前未满足病原体的新疫苗。传统方法已难以满足对分子定义明确、批次间一致性高且针对新兴血清型的疫苗需求，这促使该领域向精确控制生产因素的技术方向演进。

该综述系统梳理了糖缀合物疫苗领域过去两年的关键突破。研究人员指出，现代糖缀合物疫苗的发展正沿着三条主线协同推进：化学或化学酶法（chemoenzymatic）合成聚糖实现表位精确定义；位点选择性化学与生物缀合技术实现分子水平确定的疫苗产物；以及新型蛋白质支架与纳米载体系统拓展免疫应答的塑造能力。这些进展共同推动了疫苗设计从经验筛选向高度理性化与分子精确化的范式转变。其重要意义在于，通过明确聚糖结构-免疫原性关系、控制糖蛋白偶联位点与密度、并采用多价纳米载体展示，能够显著提升疫苗的免疫原性、批次一致性与保护范围，为应对现有及新发感染威胁提供了更有效、广谱且经济可行的解决方案。

研究人员综合运用合成化学、化学生物学与糖工程技术。在聚糖制备方面，采用化学全合成、自动化聚糖组装及化学酶法策略构建结构明确的聚糖文库，结合糖微阵列进行抗原筛选。在缀合技术方面，运用非天然氨基酸（uAA）点击化学、二硫键桥连、C端半胱氨酸定点偶联、组氨酸标签定向连接及多组分反应（如Ugi、Passerini反应）实现位点特异性缀合；同时通过蛋白质糖链偶联技术（PGCT）在大肠杆菌等工程菌中利用寡糖基转移酶（如PglB、PglL、PglS）进行体内生物缀合。在载体系统方面，采用通用膜抗原模块（GMMA）、病毒样颗粒（VLPs）、自组装蛋白纳米笼（如ferritin、Qβ）、脂质体及生物可降解聚合物颗粒构建多价展示与免疫调控平台。此外，研究涉及临床试验队列及病原动物感染模型的免疫学评价数据。

Synthetic and semisynthetic glycans for epitope definition
研究人员通过化学或化学酶法合成手段制备了具有精确长度与组成的聚糖文库，以解析结构-免疫原性关系。针对金黄色葡萄球菌，研究者构建了含32个不同乙酰化模式的聚N-乙酰葡糖胺（PNAG）五糖文库，系统鉴定出保护性表位需求，偶联至噬菌体Qβ后诱导的强免疫应答可为被动免疫提供近完全保护。对于肺炎链球菌5型和8型荚膜多糖，研究者化学合成了从不同重复单元到十二糖的寡糖，证实抗体结合能力与免疫应答均呈现长度依赖性，其中8型多糖至少需三个重复单元才能诱导足够免疫应答。针对耐抗生素的肺炎克雷伯菌，研究者合成了肺炎克雷伯菌O2afg菌株特异性三糖重复单元二聚体，偶联至CRM197后诱导的功能性Ig^G在动物模型中降低了急性肺炎负担，并显示调理吞噬与补体介导杀菌活性。此外，研究者还鉴定了土拉弗朗西菌O抗原中的最小表位——两种含甲酰胺基团的双糖，以及空肠弯曲菌、牙龈卟啉单胞菌和铜绿假单胞菌Pel多糖的保护性糖抗原。通过自动化组装与糖微阵列筛选，研究者从牙龈卟啉单胞菌脂多糖片段中选定四糖为优势抗原。在化学酶法合成方面，研究者利用糖基转移酶逐步延伸策略组装B组链球菌（GBS）荚膜多糖Ia和Ib，发现免疫应答同样具有长度依赖性。

From random coupling to site-selective conjugation
研究人员突破了传统随机偶联的局限，发展了多种位点选择性策略。在化学策略方面，通过系统优化1-氰基-4-二甲氨基吡啶（CDAP）化学，利用快速分析工具和数学模型预测并控制糖与蛋白比例及产物尺寸；采用四组分Ugi反应和Passerini三组分反应实现一锅法多聚糖与TT或异氰蛋白的缀合，产生与单价疫苗混合物相当的抗体应答。在定点偶联方面，非天然氨基酸（uAA）点击化学平台成功将A组链球菌表面蛋白SpyAD与细菌多糖GAC位点特异性连接，所得缀合疫苗在动物模型中诱导杀菌抗体并提供保护；而针对CRM197二硫键桥连策略的比较研究表明，破坏载体蛋白结构完整性会显著降低缀合物免疫原性，提示保留载体天然构象至关重要。通过C端半胱氨酸马来酰亚胺化学，研究者将脑膜炎奈瑟菌和肺炎链球菌寡糖定点连接至fHbp载体，发现免疫原性较弱的多糖在单一位点连接时需要更长链长，而免疫原性较强的多糖则以较短链即可达到最佳应答。“双打击”糖工程策略则在大肠杆菌周质中通过乳糖handle将肺炎克雷伯菌K2和O1v1抗原定点连接，实现双抗原呈递。蛋白质糖链偶联技术（PGCT）利用PglB、PglL、PglS等寡糖基转移酶在体内实现多糖与蛋白质的自动偶联，已产生针对痢疾志贺菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的低成本候选疫苗；该工程化系统还被用于构建多价B组链球菌疫苗和MAPS（Multiple Antigen-Presenting System，多抗原呈递系统）24价肺炎球菌疫苗。

New carriers, nanoparticles, and particulate display systems
研究人员探索了多种替代传统蛋白载体的新型颗粒展示系统。GMMA作为工程化外膜囊泡，可内在展示O抗原与膜蛋白，已用于制备四价痢疾志贺菌疫苗及肺炎克雷伯菌候选疫苗，在动物模型中显示出良好保护效力与低毒性。Qβ噬菌体样颗粒通过高密度有序展示B组链球菌II型荚膜多糖，仅需单次免疫即可诱导与CRM197缀合物两次免疫相当的强功能性免疫应答，展现出单剂疫苗的开发潜力。铁蛋白纳米颗粒负载布鲁氏菌相关O特异性多糖类似物可诱导T滤泡辅助细胞（T follicular helper cells）、生发中心B细胞（germinal center B cells）应答及保护性免疫；研究还表明球形铁蛋白纳米颗粒偶联脑膜炎奈瑟菌W型荚膜多糖比elongated nanotubes诱导更优的抗体应答与杀菌活性。SpyTag/SpyCatcher技术被用于可控地将痢疾志贺菌2a型O多糖展示于不同病毒样颗粒表面，保持强淋巴结靶向与体液免疫激活。此外，金糖纳米颗粒负载伯氏考克斯菌脂多糖及多种免疫原性抗原可在小鼠模型中提供针对鼻内感染的完全保护；聚乳酸（PLA）颗粒配制的伤寒Vi多糖与r-flagellin纳米糖缀合物可诱导单剂强免疫应答；经鼻递送负载α-半乳糖基神经酰胺的肺炎球菌多糖脂质体则在呼吸道和系统循环中诱导保护性Ig^A与Ig^G。

讨论与结论
研究指出，近年来糖缀jugate疫苗领域在三大方向取得了实质性进展。化学与化学酶法合成defined carbohydrate epitopes（定义的碳水化合物表位）的能力使得可及于前所未有的复杂聚糖结构，助力描绘结构-免疫原性关系。缀合方法学同样经历了重大革新，引入了保持载体完整性的复杂位点选择性化学策略，以及基于非天然氨基酸的精确缀合控制。与此同时，糖工程与生物缀合平台已趋成熟，为生产分子定义明确的缀合物提供了可扩展且经济高效的解决方案，且常与新型载体系统整合。

载体蛋白景观已显著拓展，超越了传统的可溶性蛋白，涵盖高免疫原性的自组装蛋白纳米颗粒、VLPs及工程化OMVs/GMMA。这些纳米载体通过提供内在佐活性、多价展示及增强的抗原呈递贡献于更优的免疫应答与保护。病原体衍生蛋白作为载体的出现，及其天然糖基化免疫原性作用的新见解，进一步扩展了双靶向疫苗的设计可能性。

横跨合成聚糖、可控缀合与新型载体这三领域的协同进展，凸显了向高度理性化与分子精确化糖缀合物疫苗设计的明确转变。这一趋势有望为应对现有及新发感染威胁提供更为有效、广谱覆盖且经济可行的疫苗。