微囊化干酪源Lacticaseibacillus casei与Lactobacillus acidophilus对HFD/STZ诱导2型糖尿病大鼠脂肪因子、脂质谱及炎症信号通路的改善作用

《Current Research in Biotechnology》：Microencapsulated cheese-derived Lacticaseibacillus casei and Lactobacillus acidophilus improve adipokines, lipid profile, and inflammatory signaling in HFD/STZ-induced type 2 diabetic rats

　　

2型糖尿病（T2DM）是一种以持续性高血糖、胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱为特征的慢性代谢性疾病。全球患病率预计到2030年将超过6.4亿，其伴随的微血管和大血管并发症带来沉重的社会经济负担。脂肪组织现已被认定为分泌生物活性介质（即脂肪因子）的活跃内分泌器官，在代谢调控中处于核心地位。其中，瘦素（leptin）与脂联素（adiponectin）作用相反：代谢综合征中瘦素水平通常升高，促进全身性炎症；而脂联素作为关键的胰岛素增敏和抗炎介质发挥作用。因此，瘦素与脂联素比值正成为 cardiometabolic 风险的新兴稳健指标。尽管标准化药物干预（如二甲双胍、SGLT2抑制剂）是血糖控制的基础，但长期依从性和副作用问题持续存在。这激发了对补充策略的兴趣，如益生菌补充，其可能通过调节肠道菌群、增强肠道屏障完整性以及抑制NF-κB和TLR4等促炎级联反应来改善血糖稳态和脂质谱。益生菌治疗的一个关键限制是在胃肠道转运过程中维持细胞活力。微囊化已成为保护益生菌细胞免受恶劣环境条件（如胃酸和胆盐）影响的关键技术，与未包埋制剂相比可能增强其治疗效力。尽管荟萃分析支持益生菌对T2DM的代谢益处，但包埋与游离形式之间的头对头实验比较——特别是关于其对脂肪因子调节和分子代谢信号的影响——仍然有限。据此，本研究评估每日口服补充干酪源L. casei和L. acidophilus（以微囊化和非微囊化形式给药）在HFD/STZ诱导糖尿病大鼠模型中的效果。研究人员专门检查这些干预对脂质参数和循环脂肪因子（瘦素/脂联素）的影响，同时通过炎症和代谢信号通路的分子分析阐明潜在的免疫代谢机制。

研究背景方面，2型糖尿病（T2DM）是以持续高血糖、胰岛素抵抗和脂质代谢紊乱为特征的慢性代谢病，全球患病率持续攀升，其微血管与大血管并发症带来沉重社会经济负担。脂肪组织作为活跃内分泌器官分泌脂肪因子，其中瘦素（leptin）在代谢综合征中升高并促进全身炎症，脂联素（adiponectin）则具胰岛素增敏与抗炎作用，瘦素/脂联素比值被视为心脏代谢风险的新兴指标。标准化药物干预虽为血糖控制基础，但长期依从性与副作用问题促使研究人员探索益生菌等补充策略。益生菌治疗的关键限制在于胃肠道转运中细胞活力的维持，微囊化技术可保护菌细胞免受胃酸与胆盐等恶劣条件影响，可能增强治疗效力。然而包埋与游离形式在脂肪因子调节及分子代谢信号方面的头对头实验比较仍然有限。基于此，研究人员评估了干酪源L. casei与L. acidophilus（微囊化与非微囊化形式）在HFD/STZ诱导糖尿病大鼠模型中的效果，检查其对脂质参数和循环脂肪因子（瘦素/脂联素）的影响，并通过炎症与代谢信号通路的分子分析阐明潜在免疫代谢机制。研究得出，微囊化L. casei与L. acidophilus在模拟胃肠道条件下显示改善的功能稳定性，在HFD/STZ诱导糖尿病大鼠模型中较游离形式发挥更一致的益处：补充益生菌有利地调节关键代谢结局，包括降低瘦素、升高脂联素、改善血清脂质谱（降低总胆固醇、甘油三酯和LDL-C，升高HDLC）以及减轻糖尿病相关体重丢失；分子水平上，治疗上调参与脂联素信号和葡萄糖/能量代谢的基因（Adipoq、Ppar-γ、Ampkα、Glut4和AdipoR1），同时下调炎症和脂肪生成标志物（Lep、Nf-κb、Il-6、Tnf-α和Srebp-1c），支持代谢与抗炎联合作用模式。这些发现表明微囊化益生菌制剂可能成为缓解T2DM代谢紊乱的有前景的辅助策略，但仍需机制验证和精心设计的临床研究确认。研究意义在于为微囊化益生菌作为T2DM辅助干预提供了实验依据。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：从伊朗西北部农村手工干酪无菌采集样品，经MRS肉汤富集乳酸菌（LAB）；采用革兰染色、触酶与氧化酶试验及碳水化合物发酵谱进行生化鉴定，并通过16S rRNA基因（约1500 bp，引物27F/1492R）PCR扩增、测序及BLAST比对进行分子鉴定；采用体外试验评估益生菌特性，包括酸（pH 2.5，3 h）与胆盐（0.3% oxgall，4 h）耐受性、细胞表面疏水性（微生物黏附烃类法，xylene）、自聚集与共聚集（与Listeria monocytogenes和Escherichia coli）及琼脂圆片扩散法抗菌活性；通过Kirby–Bauer圆片扩散法和7%绵羊血琼脂评估抗生素敏感性与溶血活性；以脱脂乳（35% w/v）为包埋基质，经凝乳酶与氯化钙交联、植物油乳化形成微胶囊；动物实验采用48只8周龄雄性Wistar大鼠（200 ± 20 g，来源为Tabriz医科大学动物繁育中心），经3周高脂饮食（HFD）后单次腹腔注射链霉素佐菌素（STZ；35 mg/kg）诱导糖尿病，随机分为6组（每组n = 8）干预6周；通过ELISA测定血清瘦素、脂联素及p-AMPK、GLUT4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α、AdipoR1蛋白水平，采用实时定量PCR（qRT-PCR，2?ΔΔCt法，β-actin为参照基因）检测肝脏与附睾脂肪组织基因表达，并以光度计试剂盒测定血脂，Friedewald公式计算LDL-C。

研究结果方面：3.1 益生菌菌株的分离与鉴定——从伊朗西北部Moghan农村采集的10份传统干酪样品经MRS培养获得15株推定LAB分离株，经表型特征（菌落形态、革兰染色、触酶反应和生化筛选）鉴定出5株（CH1–CH5）符合LAB特征；安全性评估显示CH1和CH2为γ-溶血（非溶血表型），其余菌株呈α或β溶血被排除；CH1和CH2抗生素敏感性谱在筛选策略范围内可接受；16S rRNA基因测序鉴定CH1为L. casei、CH2为L. acidophilus，序列登录GenBank（CH1登录号PV992402，CH2登录号PV992292）。3.2 益生菌特性评估——基于模拟胃肠道应激耐受、细胞表面相关特性和抗菌活性评估5株干酪源分离株，CH1和CH2持续显示最有利功能谱：0.3%胆盐4 h后存活率分别为64.63 ± 2.12%和65.14 ± 1.63%，pH 2.5 3 h后分别为71.14 ± 2.02%和70.25 ± 1.74%，显著高于其余菌株（p < 0.05）；疏水性分别为63.15 ± 1.54%和65.35 ± 1.87%，自聚集分别为68.28 ± 2.43%和66.32 ± 2.56%，与L. monocytogenes和E. coli共聚集值均超过50%；抗菌活性显示对E. coli、S. aureus、L. monocytogenes和S. typhimurium的抑菌圈直径21–27 mm，而CH3–CH5显示弱或无抑菌活性。3.3 所选菌株的安全性评估——基于溶血活性和抗生素敏感性评估5株分离株，CH1和CH2显示最可接受安全性谱：均为γ-溶血；对头孢克肟（CH1 26.31 ± 1.52 mm，CH2 25.16 ± 1.58 mm）、阿莫西林-克拉维酸（CH1 23.54 ± 1.76 mm，CH2 29.45 ± 1.01 mm）和阿莫西林（CH1 19.43 ± 1.21 mm，CH2 25.23 ± 1.77 mm）敏感；CH3、CH4和CH5安全性相关特征较差，对万古霉素、环丙沙星和头孢氨苄敏感性较弱或无，且CH3和CH4呈α溶血、CH5呈β溶血被排除。3.4 益生菌补充对糖尿病大鼠模型的影响——3.4.1 血清瘦素水平：糖尿病对照组（D组）血清瘦素最高（13.79 ± 1.21 ng/mL），健康对照组（A组）为10.19 ± 0.96 ng/mL，健康+游离益生菌组（B组）为9.74 ± 1.04 ng/mL，健康+微囊化益生菌组（C组）为9.17 ± 0.89 ng/mL；糖尿病+游离益生菌组（E组）降至11.06 ± 0.97 ng/mL，糖尿病+微囊化益生菌组（F组）降至10.58 ± 1.02 ng/mL；D组血清瘦素显著高于F组（p < 0.05），E组亦低于D组但差异较不明显，表明益生菌补充特别是微囊化形式与糖尿病相关循环瘦素升高衰减相关。3.4.2 血清脂联素水平：D组脂联素最低（0.33 ± 0.02 ng/mL），A组为0.54 ± 0.03 ng/mL，B组和C组分别为0.59 ± 0.04和0.68 ± 0.03 ng/mL，E组为0.49 ± 0.01 ng/mL，F组为0.61 ± 0.02 ng/mL；E组和F组显著高于D组（p < 0.05），F组增幅大于E组，C组最高，表明微囊化益生菌补充与脂联素最显著增加相关。3.4.3 血清脂质谱：糖尿病诱导伴随明显血脂异常，D组总胆固醇（106.37 ± 4.8 mg/dL）、甘油三酯（86.02 ± 2.65 mg/dL）和LDL-C（58.75 ± 1.31 mg/dL）显著升高，HDL-C（30.75 ± 2.02 mg/dL）显著降低；E组显著改善脂质谱，总胆固醇、甘油三酯和LDL-C分别降至81.24 ± 3.8、69.87 ± 2.21和28.12 ± 1.52 mg/dL，HDL-C升至39.12 ± 1.87 mg/dL（p < 0.05）；F组改善最显著，脂质参数基本恢复至健康对照水平（总胆固醇74.62 ± 3.2、甘油三酯62.04 ± 3.16、LDL-C 19.12 ± 1.18、HDL-C 46.21 ± 1.99 mg/dL）；健康动物B组和C组脂质谱与A组相似，C组在非糖尿病大鼠中LDL-C最低（15.64 ± 1.56 mg/dL）、HDL-C最高（43.24 ± 1.43 mg/dL）。3.5 基因与蛋白表达分析——3.5.1 脂肪因子与代谢调控基因表达（qRT-PCR）：糖尿病诱导（D组）引起脂肪组织转录向促炎和代谢受损谱转变，与A组（均归一化为1.00）相比，D组炎症介质Tnf-α（1.96 ± 0.04）、IL-6（1.97 ± 0.03）和Nf-κb（1.74 ± 0.04）以及脂肪生成调控因子Srebp-1c（1.61 ± 0.04）显著上调（p < 0.01），同时Glut4（0.52 ± 0.04）、Ampkα（0.33 ± 0.03）、Ppar-γ（0.48 ± 0.02）、Adipoq（0.41 ± 0.01）和AdipoR1（0.56 ± 0.04）显著抑制（p < 0.01），Lep表达亦升高（1.72 ± 0.04）；E组炎症基因表达下降（Tnf-α 1.15 ± 0.03、Il-6 1.16 ± 0.04、Nf-κb 1.15 ± 0.02、Srebp-1c 1.01 ± 0.04），代谢调控与胰岛素反应相关基因恢复（Glut4 1.39 ± 0.04、Ampkα 1.38 ± 0.03、Adipoq 0.95 ± 0.03、AdipoR1 1.34 ± 0.04）；F组改善更显著，多个靶点接近正常化或增强，包括Glut4（1.68 ± 0.02）、Ampkα（1.62 ± 0.01）、Adipoq（1.16 ± 0.02）和AdipoR1（1.48 ± 0.02），并进一步抑制炎症/脂肪生成标志物（IL-6 0.79 ± 0.02、Nf-κb 0.81 ± 0.02、Srebp-1c 0.85 ± 0.02、Tnf-α 0.97 ± 0.04）；益生菌处理糖尿病大鼠Lep表达下降（E组1.24 ± 0.02，F组1.12 ± 0.03）。3.5.2 AMPK、炎症细胞因子和脂肪因子信号标志物的蛋白水平：与A组（归一化为1.00）相比，D组磷酸化AMPK（p-AMPK；0.41 ± 0.02）、脂联素（0.51 ± 0.03）、GLUT4（0.59 ± 0.03）和AdipoR1（0.69 ± 0.04）显著降低（p < 0.01），瘦素（1.76 ± 0.03）及关键炎症标志物NF-κB（1.91 ± 0.02）、IL-6（1.98 ± 0.04）和TNF-α（2.05 ± 0.02）显著升高（p < 0.01）；E组代谢调节蛋白升高至或超过对照值，包括脂联素（0.97 ± 0.02）、p-AMPK（1.33 ± 0.05）、GLUT4（1.45 ± 0.07）和AdipoR1（1.34 ± 0.03），炎症介质降低（NF-κB 1.01 ± 0.04、IL-6 1.18 ± 0.03、TNF-α 1.01 ± 0.02）及瘦素降低（1.28 ± 0.05）（p < 0.05）；F组改善更显著，脂联素（1.24 ± 0.03）、p-AMPK（1.52 ± 0.04）、GLUT4（1.63 ± 0.04）和AdipoR1（1.58 ± 0.04）恢复最高，炎症蛋白（NF-κB 0.91 ± 0.01、IL-6 1.02 ± 0.04、TNF-α 0.92 ± 0.03）和瘦素（1.09 ± 0.04）抑制更强；非糖尿病动物B组和C组蛋白谱与健康对照组相当或适度改善，无不良改变证据。3.6 体重变化：基线体重各组无明显差异（约200 g）；干预结束时D组终末体重最低（190.45 ± 4.18 g），A组为231.36 ± 5.27 g；E组为218.27 ± 5.91 g，F组为225.76 ± 6.03 g，均显著高于D组，F组对糖尿病相关体重丢失的衰减更强；非糖尿病大鼠B组（245.53 ± 5.73 g）和C组（249.34 ± 5.64 g）终末体重高于A组。

讨论部分总结：研究人员围绕益生菌安全性、耐受性、黏附相关特性及抗菌活性筛选出CH1（L. casei）和CH2（L. acidophilus）作为优势菌株，并指出非溶血表型是益生菌安全评估的基本要求，抗生素敏感性结果在筛选策略框架内可接受。益生菌特性方面，低pH和胆盐耐受被视为益生菌发挥功能的关键前提，CH1和CH2相对较高的存活率提示其作为益生菌候选的潜在适用性；疏水性和聚集行为与黏附能力、黏膜持久性及与肠道病原体竞争性相互作用相关；抗菌活性可能与有机酸、过氧化氢和类细菌素化合物等抗菌代谢物产生有关，并有助于调节肠道微生物环境。动物实验中，糖尿病对照组瘦素升高与HFD/STZ模型代谢稳态破坏一致，益生菌给药后瘦素降低可能反映宿主代谢和炎症状态的改善调节，潜在通过影响肠道微生物组成、肠道屏障完整性和全身炎症通路实现；脂联素降低是胰岛素抵抗、肥胖和T2DM的公认特征，益生菌补充后脂联素升高提示所给菌株可能有助于恢复脂肪因子平衡和改善代谢状态；血脂异常是代谢综合征和T2DM的标志，L. casei和L. acidophilus给药的降血脂效应与特定Lactobacillus菌株调节脂质稳态的已知能力一致，潜在机制包括胆盐水解酶活性促进肝脏胆固醇清除、直接胆固醇同化或干扰肠道吸收，以及益生菌驱动的肠道微生物生态变化和短链脂肪酸（SCFAs）产生抑制肝脏脂肪生成并改善全身脂质处理；微囊化制剂更优效力提示增强的益生菌活力和向 lower gastrointestinal tract 的靶向递送可能提供更强代谢益处。基因与蛋白表达方面，转录模式支持益生菌干预与改善代谢表型之间的机制联系，Ppar-γ和Ampkα表达恢复与增强的脂质处理和改善的胰岛素敏感性一致，Glut4增加提示胰岛素刺激葡萄糖摄取能力改善，Nf-κb、Tnf-α和IL-6下调表明炎症信号衰减，Adipoq和AdipoR1上调提示脂联素轴再激活；蛋白水平发现与qRT-PCR结果相互印证，AMPK磷酸化恢复提示促进葡萄糖利用和脂肪酸氧化的细胞能量感应通路再激活，GLUT4和AdipoR1同时增加与改善的胰岛素反应性和增强的脂联素信号能力一致，NF-κB及其下游细胞因子（IL-6和TNF-α）水平降低表明慢性低度炎症衰减，微囊化制剂相对更强的效果进一步支持包埋增强益生菌稳定性和递送从而放大下游代谢与免疫调节益处的 premise。体重方面，体重丢失是糖尿病的公认后果，常归因于胰岛素作用受损和葡萄糖利用减少导致的分解代谢转变，游离和微囊化益生菌均减轻糖尿病动物这一不良结局，提示全身能量平衡部分改善；微囊化益生菌相对更强的效果与包埋改善胃肠道转运中益生菌活力并增强肠道递送的原理一致。研究结论翻译：微囊化L. casei和L. acidophilus在模拟胃肠道条件下显示改善的功能稳定性，并在HFD/STZ诱导糖尿病大鼠模型中较游离形式发挥更一致的益处。益生菌补充有利地调节关键代谢结局，包括降低瘦素和升高脂联素、改善血清脂质谱（降低总胆固醇、甘油三酯和LDL-C；升高HDLC）以及减轻糖尿病相关体重丢失。在分子水平上，治疗上调参与脂联素信号和葡萄糖/能量代谢的基因（Adipoq、Ppar-γ、Ampkα、Glut4和AdipoR1），同时下调炎症和脂肪生成标志物（Lep、Nf-κb、Il-6、Tnf-α和Srebp-1c），支持代谢与抗炎联合作用模式。总体而言，这些发现表明微囊化益生菌制剂可能代表缓解T2DM代谢紊乱的有前景辅助策略；然而，机制验证和在精心设计的临床研究中的确认仍是必需的。