《Scientific Reports》：MnOx nanoparticles cause broad transcriptomic deregulation in A549 cells, unlike graphene-MnOx composites
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纳米材料（NMs）因其纳米级尺寸和反应活性而构成显著的、尚未明确的职业健康风险，尤其是通过吸入途径暴露。鉴于这一主要暴露途径，研究人员采用毒性转录组学（toxicotranscriptomics）研究了A549人肺上皮细胞的毒理学响应。这些细胞暴露于游离的氧化
纳米材料（NMs）因其纳米级尺寸和反应活性而构成显著的、尚未明确的职业健康风险，尤其是通过吸入途径暴露。鉴于这一主要暴露途径，研究人员采用毒性转录组学（toxicotranscriptomics）研究了A549人肺上皮细胞的毒理学响应。这些细胞暴露于游离的氧化锰纳米颗粒（MnOx NPs）以及原始或降解的石墨烯-MnOx纳米复合材料。转录组学分析揭示了两种材料形式之间响应特征的鲜明对比。MnOx NPs（GNA35）引起跨多条通路的广泛而显著的转录组失调，包括与细胞应激和凋亡相关过程的显著富集。相反，原始和降解的石墨烯-MnOx纳米复合材料（GNA15和GNA15d）仅诱导极微量和有限的转录响应，表明其毒性特征显著降低。该转录证据表明，MnOx NPs在石墨烯表面的金属固定化有效减轻了其固有毒理学活性。此外，降解后未出现毒性增强，表明该复合材料保持了其保护能力。这些发现强烈提示，将金属基NMs（如MnOx）整合到石墨烯复合材料中可显著提高其在职业操作中的安全性。
**研究背景与问题**
纳米材料（NMs）在材料科学中具有广泛的应用前景，其独特的理化性质已革新了电子学、能源、汽车和医疗等多个领域。然而，纳米技术的快速发展及新型配方的不断涌现可能对人类健康构成严重风险，这在职业环境中尤为突出，因为生产设施中的工人可能持续暴露于NMs。NMs的威胁在于其良好的细胞内化能力，而相关的分子和细胞内相互作用在许多情况下仍不明确。目前大多数研究集中于简单纳米形态，而对组成更为复杂的NMs在其完整性丧失后的风险评估研究较为匮乏。特别是基于碳衍生纳米形态与过渡金属氧化物（TMOs）杂化而产生的新一代NMs，因其在催化、磁性和光电性能方面的有趣特性而受到关注。然而，碳衍生NMs的功能化从毒理学角度提出了问题，因为这可能导致所添加基团的释放，尤其是由于物理或生物降解所致。纳米颗粒的内化及其降解可能释放离子，直接干扰细胞金属稳态，这超出了纳米颗粒进入细胞本身的固有风险。碳基质中含Mn配合物的材料在储能领域正被广泛研究，但这些新型材料也引发了对其潜在联合毒性的担忧。石墨烯的毒性可诱导炎症反应、DNA损伤、凋亡和自噬，而Mn在高浓度下可与过氧化氢反应释放活性氧（ROS），过量ROS可参与细胞恶性转化或触发凋亡。基于研究团队此前的两项研究——第一项评估了具有增强电化学性能的Mn氧化物NMs通过三种潜在暴露途径的毒性，第二项提供了石墨烯与Mn氧化物NMs潜在协同毒性的新见解，并报道了掺入MnOx使多组分纳米材料的细胞毒性低于单独石墨烯，且该保护效应在降解后持续存在——本研究提出假设：石墨烯-MnOx复合材料（GNA15或GNA15d）的保护效应将转化为有限的分子响应，与游离MnOx NPs（GNA35）相比。具体而言，旨在确认MnOx固定化是否可转化为对游离金属氧化物效应的潜在抑制或实质性限制，以及该保护能力在复合材料降解后是否得以保留。为验证假设，研究人员在人肺细胞系A549上开展了比较转录组学研究，以评估职业环境中特别相关的吸入风险。
**关键技术方法**
研究使用A549人肺腺癌细胞系作为肺组织暴露模型，暴露于GNA35（20 mg L?1，4.17 μg cm?2）、GNA15和GNA15d（均为40 mg L?1，8.33 μg cm?2），暴露24小时后提取总RNA。通过RNA测序（RNA-Seq）获取转录组数据，使用fastp进行数据清洗，STAR软件映射至人类参考基因组GRCh38，DESeq2 R包进行差异表达计算（FDR < 0.05，|log2 Fold Change| ≥ 0.585）。功能注释和GO富集分析通过Panther完成，KEGG通路映射用于生化通路的差异表达基因（DEGs）可视化。每种条件设三个生物学重复。
**研究结果**
*纳米材料选择与表征*：通过TEM分析显示GNA15d较GNA15具有更高程度的剥离，DLS分析显示两者在细胞培养基中重悬后粒径分别为509 ± 46.1 nm和250.3 ± 6.7 nm。GNA15降解导致上清液中Mn离子浓度从10.25 ppb增至93.13 ppb。GNA35的TEM粒径约100 nm，DLS值为338 ± 0.6 nm。
*A549细胞对GNA35及GNA15原始和降解形式的转录响应概述*：主成分分析（PCA）显示PC1解释超过90%的方差，GNA35样本沿PC1与其他样本明显分离，而对照、GNA15和GNA15d沿PC2的差异极小，表明这些样本间全局转录组谱高度相似。
*差异表达基因概述*：GNA35暴露产生最多DEGs，而GNA15和GNA15d暴露导致的转录变化显著较少。热图分析进一步确认GNA35暴露的独特基因表达谱。维恩图鉴定出191个核心基因在所有暴露条件下均显示转录变化。
*功能富集分析*：在生物学过程（BP）类别中，GNA15富集20个术语（主要与ATP代谢、碳水化合物代谢和糖酵解相关），GNA35富集391个术语（主要与RNA和蛋白质合成及修饰相关），GNA15d无显著富集。在分子功能（MF）类别中，仅GNA35鉴定出113个富集术语。在细胞组分（CC）类别中，仅GNA35富集151个术语。Panther通路分析显示GNA15和GNA15d均富集糖酵解通路，GNA35富集凋亡信号通路、p53信号通路等。Reactome通路分析显示GNA35富集450条通路，主要与细胞应激和刺激响应、RNA和蛋白质代谢、翻译及蛋白质折叠相关。
*KEGG通路评估*：GNA35暴露下175个DEGs映射至hsa05200（癌症通路），而GNA15和GNA15d分别仅2个和4个。GNA35条件下疾病相关通路数量显著高于GNA15和GNA15d，而代谢和能量产生相关通路在GNA15（5/15）和GNA15d（3/15）中更为突出。
**讨论与结论**
讨论部分指出，GNA35引起的转录组扰动规模显著大于GNA15或GNA15d，尽管表型试验（如活力和ROS测量）提示的效应较轻。这种差异凸显了纳米材料-细胞相互作用的复杂性，并强调了仅依赖表型试验评估毒性的局限性。GNA35使用的浓度仅为GNA15或GNA15d的一半（以保持MnOx含量的化学计量等效），但其在转录组水平的影响不成比例地大，提示纳米材料的功能化和结构特性 contribute 于观察到的差异。在GNA15中，MnOx组分可能被"隔离"在石墨烯纳米片内，限制了细胞相互作用。功能富集分析显示GNA35诱导广泛的生物学响应，而GNA15和GNA15d效应明显较窄。通路水平分析表明GNA15和GNA15d主要诱导与糖酵解过程相关的变化，而GNA35引发凋亡通路和p53信号通路相关响应。在Pisani等人的分级应激响应框架中，GNA35诱导的转录响应在幅度上与SiO?纳米颗粒相当。GNA15和GNA15d在Level 1和Level 2类别中未诱导显著表达变化（定义为fold change > 2）。Level 3中GNA15和GNA15d的DEGs较为突出，但失调程度仍显著低于GNA35。研究承认三个主要局限性：24小时暴露期仅为短期评估；使用2D细胞单培养简化了复杂的人肺环境；RNA-seq数据 alone 不能 definitive 证明功能性激活。结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员采用比较转录组学方法研究了三种锰基纳米材料对A549人肺上皮细胞系的毒物基因组学效应。观察到暴露于游离氧化锰纳米颗粒（GNA35）的细胞与暴露于固定化纳米颗粒（GNA15和GNA15d）的细胞之间转录响应存在显著差异。GNA35暴露导致基因表达的实质性更大失调。数据表明，尽管所有三种纳米材料均在A549细胞中引发毒性响应，但如果仅使用经典试验，GNA35的长期影响可能被低估。转录组学分析揭示基本细胞过程的显著损伤，包括一般代谢活动和蛋白质合成。从安全-by-design（SbD）角度看，转录组学是一种强大的预测工具，能够在不良细胞响应表现为可观察表型变化之前识别它们。本研究证明转录组学分析可显著增强异生物质风险评估，提供潜在长期危害的早期预警。具体而言，比较数据提供了分子证据表明MnOx在石墨烯基质内的固定化减轻了游离纳米颗粒观察到的严重转录组扰动。然而，单独固定化可能不能保证完全保护，因为降解的功能化纳米材料引发比完整对应物更强的ROS响应，这可能在将来构成风险，必须通过进一步研究评估。总体而言，这些发现有助于指导进一步SbD原则的应用，将材料功能化确定为降低纳米毒性同时保持功能性能的有效设计变量，从而促进更安全和更可持续的纳米材料应用。
