大口黑鲈复合体年龄-生长关系的表观遗传模式：全基因组胞嘧啶DNA甲基化作为生长预测分子标志物的鉴定

《North American Journal of Fisheries Management》：Epigenetic patterns associated with size-at-age relationships in the Largemouth Bass complex

　　

目的：大口黑鲈（Micropterus nigricans）、佛罗里达鲈（M. salmoides）及其杂交渔业（以下统称大口黑鲈复合体[Largemouth Bass complex, LBc]）的渔业管理工作中，为商业和休闲目的生产健壮个体是重要举措。调节基因活性并与生理驯化相关的表观遗传信号，如胞嘧啶DNA甲基化（DNA methylation）模式，已作为生物体健康（organismal health）与生长（growth）的潜在生物标志物受到关注。鉴于性二态性（sexual dimorphism）与环境变异之间复杂的相互作用，鉴定能够预测LBc生长及相应年龄-生长（size-at-age）模式的分子信号，对于旨在维持 trophy 鲈鱼渔业（trophy fisheries）的放流工作至关重要。

方法：结合德克萨斯州公园与野生动物部（Texas Parks and Wildlife Department）采集的总长度、鳍条样本及对应耳石样本，研究人员于2023—2024年从邻近美国橡树岭国家实验室（Oak Ridge National Laboratory）的田纳西州水域采集LBc样本，合并形成包含138尾个体的数据集。所有鲈鱼个体年龄采用耳石分析进行估计。随后对提取的鳍条DNA进行DNA甲基化模式评估，最终数据集包含来自77尾德克萨斯州LBc样本（38尾雄性、39尾雌性）和61尾田纳西州LBc样本（23尾雄性、38尾雌性）的2,138,275个胞嘧啶位点。研究比较了全局平均DNA甲基化以及随年龄-生长变化的位点特异性模式（该模式基于以季节为随机效应（random effect）的线性混合效应模型[linear mixed-effects model]残差鉴定）。所鉴定区域根据胞嘧啶密度以及与基因的距离进行注释。为鉴定受差异甲基化信号影响的生理模式，研究利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因与基因组百科全书）功能通路数据库，对与显著差异位点相关基因列表的通路富集情况进行了评估。

结果：随着LBc成员年龄-生长增加，全局平均DNA甲基化水平下降。研究人员鉴定出8,247个甲基化状态与LBc成员年龄-生长关系显著相关的位点，以及与性因素和环境因素分别相关的10,963个和119个位点。MAPK、钙（calcium）、mTOR、Wnt、ErbB、GnRH、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol）和胰岛素（insulin）信号等生理通路的富集受到这些位点差异甲基化的影响，证实了先前关于鲈鱼及其他硬骨鱼类（teleost）的研究结果。

结论：研究人员鉴定了表观遗传模式在LBc成员生长及由此产生的年龄-生长关系中的作用。在后续工作中针对所鉴定区域进行检测方法开发，可能为水产养殖（aquaculture）实践以及成功 trophy 鲈鱼渔业的管理提供有价值的资源。

**研究背景、内容与意义**

休闲钓是全球规模最大的水上户外活动之一，带来可观的社会机会与收益，并对保护工作产生积极影响。大口黑鲈（Micropterus nigricans）是北美特有的肉食性鱼类，因食性凶猛、生长迅速、成体体型大、咬钩后搏斗性强，成为理想的游钓鱼种，并支撑着庞大的商业产业。年龄-生长关系（size-at-age relationship，即全长与年龄的对应关系）被广泛用于指导放流程序和垂钓法规制定。大口黑鲈幼鱼生长迅速，但其后续生长及年龄-生长关系受猎物可得性、性别、环境条件与地理位置（例如生长与纬度呈负相关）等因素影响。为获得大型"trophy"鲈鱼，许多地区放流佛罗里达鲈（Florida Bass, M. salmoides）或与本地大口黑鲈杂交，由此形成的群体被统称为大口黑鲈复合体（Largemouth Bass complex, LBc）。此前研究已利用已知生长相关基因及其下游功能通路预测LBc成员的生长与体型，而DNA甲基化（DNA methylation，即在胞嘧啶C5位点添加或去除甲基、不改变潜在核苷酸序列的表观遗传修饰）作为重要的表观遗传信号，与性别决定、衰老和环境响应等多种生理功能相关，但其在LBc年龄-生长关系表征中的应用仍然有限。为此，研究人员开展了本研究，旨在评估DNA甲基化信号与LBc成员年龄-生长关系的关联，同时注释受这些关联影响的生理功能，以服务于该trophy物种的种群管理与放流实践。研究最终得出全局平均DNA甲基化随年龄-生长增加而下降、并鉴定出大量年龄-生长相关甲基化位点及富集生理通路的结论，其意义在于为水产养殖与trophy鲈鱼渔业管理提供了可靶向开发的分子资源。

**关键技术与样本队列**

样本队列包括德克萨斯州公园与野生动物部采集的77尾LBc（38雄、39雌）与2023—2024年田纳西州橡树岭国家实验室邻近水库电捕的61尾（23雄、38雌），另含鱼苗（Fish Wagon Hatchery），合计138尾；年龄以耳石轮纹计数估计。关键技术方法包括：两种全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）建库方案结合Illumina NovaSeq 6000双端测序；Bismark比对后保留出现于≥60%样本的2,138,275个CpG位点；以季节为随机效应的线性混合效应模型提取体长-年龄残差；DSS差异甲基化分析（beta-binomial模型，FDR<0.05）；CpG密度与基因邻近度注释及精确二项检验；clusterProfiler的KEGG通路富集分析。

**研究结果**

全局DNA甲基化与LBc成员年龄-生长关系的全局关联：线性混合效应模型（按Nakagawa的R²算法）显示，LBc体长与年龄高度相关（边际R²_m=0.66，条件R²_c=0.82），出壳后每增加1年全长平均增加35.98 mm（SE=1.81，t₁₃₆=19.91，P<0.05）。方差分析（ANOVA）表明性别（F_1,132=1.02）、采样地点（F_1,132=0.041）和季节（F_3,132=0.93）对LBc年龄-生长模式均无显著影响。全局平均DNA甲基化随年龄-生长增加显著下降（线性回归：F_1,136=8.61，P<0.05；beta回归：β=?0.001，SE=0.0003，z=?3.06，P<0.05；精度参数φ=104.52，模型伪R²=0.06）。

差异甲基化模式：差异甲基化分析（FDR<0.05）鉴定出8,247个甲基化值与年龄-生长显著相关的位点、10,963个性别相关位点（雄性相较雌性）、119个地点相关位点（田纳西州相较德克萨斯州）以及4,153个性别×地点三级互作位点。方向性分析表明，随年龄-生长增加的超甲基化位点富集于CpG岛（CpG island）而缺失于open sea区；低甲基化位点富集于启动子与基因间区而缺失于内含子和外显子。受性别影响的低甲基化位点在雄性中富集于CpG岛、shore和shelf区；受地点影响的位点在CpG密度上无富集或缺失，但低甲基化位点缺失于内含子、富集于基因间区；三级互作位点的低甲基化位点富集于CpG岛、缺失于内含子。KEGG通路富集分析显示，年龄-生长相关位点及性别、地点相关位点的低甲基化与超甲基化分别富集于MAPK、钙、mTOR、Wnt、ErbB、GnRH、磷脂酰肌醇和胰岛素信号等生理通路，证实了先前关于鲈鱼及其他硬骨鱼类的研究结果。

**讨论部分总结**

研究人员将本研究结果与已有发现进行了比较。全局平均DNA甲基化与较大年龄-生长的负相关此前亦在蛇鲈（Channa spp.）杂交鱼中观察到，可能与其生长相关基因表达升高有关。本研究结果证实并拓展了此前对LBc生长机制的认识：stat、pparg、akt1和mapk等基因的表达以及脂肪酸代谢、生长激素和胰岛素信号通路均与较大体型相关；本研究进一步表明DNA甲基化在维持类胰岛素生长因子（IGF）、细胞黏附分子（CAM）、钙、神经活性配体、磷脂酰肌醇和ErbB等支持性生长与发育通路中的作用，这些通路的功能涉及细胞增殖与存活、骨骼肌发育、躯体发育、转录调控和躯体生长。启动子区附近的超甲基化与基因表达及活性下降相关，可能促进细胞分裂与生长；而低甲基化可能与细胞增殖增加及达到较大体型所需的分子过程需求相关。

性别差异方面，MAPK、IgSF（免疫球蛋白超家族）、钙黏蛋白（cadherin）和钙信号等KEGG通路的年龄-生长富集模式受性别影响；与雌性相较，Wnt、胰岛素、GnRH、多梳抑制复合物（polycomb repressive complex）和VEGF（血管内皮生长因子）信号等通路在雄性中随年龄-生长增加呈超甲基化，提示这些通路活性的改变可能服务于雌性发育与生长；IgSF和MAPK信号的低甲基化则可能引导性别特异性生长与成体体型的差异表达。

地点差异方面，虽然未基于地点差异甲基化位点鉴定出富集通路，但两个地点的LBc表现出不同的年龄-生长相关生理信号模式。气温、水温与降水等环境条件可能影响DNA甲基化对生长的作用；此外，德克萨斯州采样点多为佛罗里达鲈及杂交鱼主导的渔业，而田纳西州的佛罗里达鲈渐渗（introgression）水平目前未知，两个Micropterus物种间的等位基因渐渗可能是导致甲基化差异的另一因素；已有研究显示其他鱼类杂交种相较亲本具有较低的甲基化和较高的生长。

在应用意义上，放流生长快速的个体是形成trophy鲈鱼渔业的关键措施，本研究鉴定的表观遗传关联可作为下游放流管理方法的靶标，并增进对Micropterus生长基础生物学的理解。

**研究结论（翻译）**

本研究的结论为：表观遗传模式在LBc成员生长及由此产生的年龄-生长关系中发挥作用；在后续工作中针对所鉴定区域进行检测方法开发，可能为水产养殖实践以及成功trophy鲈鱼渔业的管理提供有价值的资源。通俗而言，研究鉴定了预测LBc成员生长的潜在分子靶点，这些标志物可用于管理和放流工作，以维持和增强trophy鲈鱼渔业。