20 nm聚苯乙烯纳米颗粒经非吞噬依赖机制诱导角质形成细胞死亡破坏皮肤屏障并加剧NC/Nga小鼠抗原驱动的过敏性皮肤炎症

《Immunology Letters》：Polystyrene nanoparticle-induced keratinocyte death compromises skin barrier integrity and augments antigen-driven allergic skin inflammation in NC/Nga mice

　　

聚苯乙烯纳米颗粒诱导的角质形成细胞死亡破坏皮肤屏障完整性并加剧NC/Nga小鼠抗原驱动的过敏性皮肤炎症。研究表明，聚苯乙烯纳米颗粒以不依赖于吞噬作用的方式诱导角质形成细胞死亡。在单层培养的角质形成细胞中，聚苯乙烯纳米颗粒可增强其通透性。在经抗原处理的NC/Nga小鼠中，聚苯乙烯纳米颗粒会加重皮炎，诱导Th2型免疫应答，并增加皮肤通透性。

现代化进程中，塑料废弃物持续增加，预计2050年年产量将达6.87亿吨，约为2020年的1.6倍。塑料垃圾经填埋或环境释放后，通过海洋、大气、湖泊及土壤迁移，并降解为微塑料（< 5 mm）及纳米塑料（< 100 nm），且已在人体器官中被检出。既往研究表明，结晶硅、无定形硅、碳纳米管及二氧化钛等环境或工业来源颗粒可诱发炎症性疾病，如尘肺和过敏性哮喘；聚苯乙烯（polystyrene，PS）颗粒亦可在小鼠肝脏和肠道诱导炎症。颗粒物质可通过激活NOD样受体家族pyrin结构域包含蛋白3（NLRP3）炎症小体、caspase-1及消皮素D（gasdermin D）诱导细胞焦亡（pyroptosis）和白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1_β）释放，但塑料纳米粒对皮肤主要组成细胞——角质形成细胞（keratinocyte）的细胞毒性、作用机制（是否依赖吞噬）及其对过敏性皮肤炎症的影响尚不明确。角质形成细胞作为表皮主要构成细胞，吞噬能力有限。因此，研究人员开展本研究旨在评估PS纳米粒对角质形成细胞的细胞毒性及其破坏皮肤屏障、加剧抗原驱动性过敏性皮肤炎症的风险。

研究人员以20 nm、200 nm及2,000 nm PS颗粒为研究对象，通过体外细胞实验与NC/Nga小鼠在体模型，系统探讨PS纳米粒对皮肤屏障功能及过敏性炎症的影响。研究发现，PS20可独立于吞噬作用诱导角质形成细胞死亡，破坏角质形成细胞屏障完整性并增加40-kDa异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FD40）通透性；在NC/Nga小鼠中，皮内共同涂抹PS20与尘螨抗原（Dp）可显著增加皮肤通透性、加剧特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）样病变，并伴随Th2型免疫应答（Th2 responses）增强及抗原特异性IgE产生。该研究首次提示，PS纳米粒经皮暴露可能是过敏性皮肤炎症的加剧因素，其机制与角质形成细胞损伤及表皮屏障破坏密切相关，为评估塑料纳米颗粒的皮肤健康风险提供了实验依据。

研究人员采用乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放实验检测细胞死亡率；利用Transwell系统评估角质形成细胞单层通透性；通过细胞松弛素D（cytochalasin D）干预及Casp1^?/?小鼠模型验证PS20诱导细胞死亡是否依赖吞噬作用，并运用多种细胞死亡通路抑制剂探究其机制。在体研究采用NC/Nga小鼠（样本队列来源：Japan SLC），经皮涂抹结合胶带剥离（tape stripping）建立抗原致敏模型，通过耳厚度测量、临床评分、苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、实时定量PCR、免疫荧光及FD40通透示踪等技术评价皮炎严重程度、Th细胞因子表达、IgE水平及皮肤屏障功能。

3.1 20 nm PS颗粒强烈诱导角质形成细胞死亡并破坏屏障完整性
研究人员首先比较了PS20、PS200及PS2,000对小鼠原代角质形成细胞的毒性差异。结果显示，PS20在150–300 μg/mL刺激2 h后，或在低至25 μg/mL刺激24 h后，即可显著诱导细胞死亡，而PS200和PS2,000在相同条件下未显示明显细胞毒性。为探究PS20诱导死亡的作用机制，研究人员利用肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D进行干预，发现其未能抑制PS20诱导的角质形成细胞死亡，提示该过程不依赖于吞噬作用。进一步采用Casp1^?/?小鼠来源的角质形成细胞，以及caspase抑制剂Z-VAD-FMK、RIP激酶1抑制剂necrostatin-1、铁死亡（ferroptosis）相关脂质过氧化抑制剂ferrostatin-1和自由基清除剂BHA分别处理，结果均不能抑制PS20诱导的细胞死亡。上述发现表明，在此实验条件下，PS20诱导的角质形成细胞死亡不符合经典的caspase-1依赖性焦亡（pyroptosis）、凋亡（apoptosis）、坏死性凋亡（necroptosis）或铁死亡特征。在人角质形成细胞系HaCaT中，PS20同样可诱导显著的LDH释放。Transwell通透性实验显示，与单独应用FD40相比，PS20与FD40共同处理组的下室荧光强度显著升高，表明PS20可损伤角质形成细胞单层屏障并增加其通透性。

3.2 皮内涂抹PS20加剧尘螨抗原诱导的NC/Nga小鼠AD样病变
为在体验证PS20对过敏性皮肤炎症的影响，研究人员对NC/Nga小鼠耳及背部皮肤反复涂抹PS20、Dp或两者混合物。结果显示，单独PS20或Dp均未引起显著病理改变，但PS20与Dp共同处理组自第2周起耳廓临床评分即呈进行性升高，并在第5周时显著高于单独Dp组；耳厚度亦显著增加。组织学分析表明，PS20+Dp组表皮明显增厚，细胞浸润显著增加，每100,000 μm²视野中的嗜酸性粒细胞（eosinophil）数量显著高于对照组及单独Dp组。

3.3 PS20与尘螨抗原皮内共同处理破坏NC/Nga小鼠皮肤屏障并诱导Th2应答
研究人员进一步检测了耳组织中代表性细胞因子的mRNA表达及血浆中抗原特异性IgE水平。结果显示，PS20+Dp组Th2型细胞因子Il4的mRNA表达显著高于对照组，而Th1型细胞因子Ifng和Th17型细胞因子Il17a的表达无显著变化；血浆中Dp特异性IgE水平亦显著升高，提示共同处理可诱导Th2型免疫应答。在皮肤通透性方面，FD40示踪显示PS20+Dp组小鼠耳皮肤中FD40穿透显著增强，部分表皮形态尚完整的区域亦出现FD40到达真皮的现象，提示存在细胞旁通路通透性增加。免疫荧光染色显示，claudin-1与occludin在形态完整表皮区的表达及分布模式在各组间未见明显减少或重排，提示该屏障功能的破坏并非由上述紧密连接蛋白的表达下调所致。

研究人员指出，PS20较PS200及PS2,000表现出更强的细胞毒性，与既往报道中20 nm范围PS纳米粒对巨噬细胞毒性更强的结果一致。PS20诱导的角质形成细胞死亡不依赖于吞噬、caspase家族、RIP激酶1或脂质过氧化，提示其可能涉及细胞膜直接损伤、肌动蛋白非依赖的内吞或膜通透性增加所导致的溶酶体功能障碍；纳米级PS颗粒因具有更大的比表面积，更易与细胞膜及胞内细胞器相互作用，从而在细胞内和细胞外均造成严重损伤。在皮肤屏障方面，尽管PS20在体外可增加角质形成细胞单层通透性，但在体内单独涂抹时FD40穿透有限，完整角质层（stratum corneum）可限制PS20到达活性表皮；而在胶带剥离及反复Dp暴露所致亚临床炎症和抓挠存在的情况下，PS20可能更易进入活性表皮并损伤角质形成细胞，进而破坏屏障、促进抗原渗透。抗原渗透增强与AD病变加重可能形成恶性循环；同时，Th2应答增强及IgE升高可促进肥大细胞脱颗粒和嗜酸性粒细胞浸润，进一步加剧炎症与组织损伤。本研究尚存在局限性：实验所用PS浓度（3 mg/mL为涂抹浓度）可能高于环境暴露水平，且主要反映角质形成细胞损伤与屏障破坏的实验能力，后续需采用更接近真实环境暴露的浓度进一步评估其人类健康相关性。

本研究中，研究人员证实20 nm聚苯乙烯纳米颗粒通过不依赖吞噬作用的机制诱导角质形成细胞死亡，进而破坏角质形成细胞屏障完整性并增强40-kDa右旋糖酐的通透。在NC/Nga小鼠中，PS20与Dp的共同应用增加了皮肤通透性并加剧了具有Th2相关特征的AD样病变。这些发现提示，PS纳米颗粒与抗原的共同暴露可能通过损伤表皮屏障而加剧抗原驱动的过敏性皮肤炎症。因此，当皮肤同时暴露于抗原时，PS纳米颗粒可能充当过敏性皮肤炎症的加剧因素。