《International Journal of Biological Macromolecules》：Trophoblast cell-surface antigen 2-directed enhancement of gene delivery using a nanobody-engineered recombinant adeno-associated virus for bispecific T-cell engager-mediated T-cell cytotoxicity in triple-negative breast cancer cells
编辑推荐：
•利用内化纳米抗体K118.1，构建了TROP2定向的rAAV-Nb载体。•K118.1能够与人和小鼠的TROP2结合，并实现高效的内化。•纳米抗体引导的衣壳工程增强了TNBC细胞中BiTE转基因的表达。•rAAV-Nb介导的BiTE表达诱导了T细胞活化并杀伤了肿瘤细胞。•该平台
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利用内化纳米抗体K118.1，构建了TROP2定向的rAAV-Nb载体。
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K118.1能够与人和小鼠的TROP2结合，并实现高效的内化。
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纳米抗体引导的衣壳工程增强了TNBC细胞中BiTE转基因的表达。
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rAAV-Nb介导的BiTE表达诱导了T细胞活化并杀伤了肿瘤细胞。
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该平台为TNBC中的受体定向基因传递提供了一种模块化策略。
引言
三阴性乳腺癌（TNBC）的特点是缺乏雌激素受体、孕酮受体和人表皮生长因子受体2的表达，具有较高的增殖能力和转移潜力[1], [2]。由于缺乏可作用的分子靶点，许多传统的分子靶向疗法效果有限，而细胞毒性化疗仍是系统性治疗的重要组成部分[3], [4]。然而，传统的化疗往往由于肿瘤选择性低而产生剂量限制性的毒性，且化疗耐药性的频繁出现导致早期复发[3], [5]。这些局限性突显了需要替代性治疗平台来改善肿瘤定向治疗的效果。在这方面，重组腺相关病毒（rAAV）载体因具有较好的安全性、低免疫原性和持久的转基因表达潜力而被广泛研究用于治疗基因传递[6], [7]。然而，传统rAAV血清型的广泛天然亲和性可能导致肿瘤细胞转导效率降低，并在肝脏等非目标组织中分布或被隔离，因此需要增强目标细胞群体中转导效率的策略[8]。尽管免疫疗法和抗体-药物偶联物（ADCs）取得了进展，但将治疗基因高效且选择性地传递到TNBC细胞仍然是开发有效癌症基因治疗的主要障碍，这进一步强调了受体定向基因传递平台的必要性。
滋养层细胞表面抗原2（TROP2）是一种I型跨膜糖蛋白，在大约80%的TNBC肿瘤中过度表达，在正常组织中的表达相对有限，使其成为受体定向基因传递的有希望的靶点[9], [10]。TROP2作为治疗靶点的临床验证实例是sacituzumab govitecan，这是一种针对TROP2的ADC，在TNBC患者中显示出显著的临床疗效[11], [12]。这些观察结果支持将TROP2作为经过临床验证的细胞表面靶点，用于受体定向基因传递。
rAAV载体的衣壳工程是受体定向基因传递的一种有前景的方法。纳米抗体源自骆驼科动物仅含有重链的抗体，具有较小的分子尺寸、高结构稳定性以及与基因融合的兼容性，使其成为AAV衣壳工程中的理想靶向结合剂。先前的研究表明，将纳米抗体或其他靶向结合剂插入暴露的AAV衣壳区域可以赋予其额外的受体依赖性转导特性[13], [14], [15]。因此，纳米抗体引导的衣壳工程可能代表了一种模块化策略，用于增强针对肿瘤相关抗原的rAAV转导。然而，以往关于纳米抗体引导的rAAV衣壳工程的研究主要集中在模型受体或概念验证应用上，将其应用于如TNBC这样的侵袭性实体瘤中的临床验证靶点的研究相对较少[13], [14], [15]。
在此，我们开发了一种TROP2定向的衣壳工程rAAV平台，使用rAAV6 VP1，通过基因工程在其GH2/GH3环中包含内化TROP2特异性纳米抗体K118.1，并评估了其在TROP2阳性TNBC细胞中的表现。选择K118.1是因为它具有高亲和力、结合目标后高效内化以及与人和小鼠TROP2的交叉反应性。选择rAAV6作为亲本衣壳，是因为它在中癌细胞中的转导效果良好[16]，并且与基于VP1的衣壳工程兼容[17]。作为概念验证的治疗载荷，我们使用了双特异性T细胞激活剂（BiTE）转基因。此外，我们研究了K118.1介导的TROP2结合是否有助于增强TROP2阳性TNBC细胞中的转基因传递和BiTE表达，并产生足够的功能性BiTE以诱导T细胞激活和T细胞依赖的细胞毒性。总体而言，我们的发现表明，纳米抗体引导的衣壳工程是一种有前景的模块化策略，可用于增强向TROP2表达的TNBC细胞的治疗性转基因传递。
部分摘录
细胞培养
Hs578T细胞（韩国细胞系库，首尔）和HEK293T细胞（美国类型培养收集机构，弗吉尼亚州马纳萨斯）在添加了10%（v/v）胎牛血清（Thermo Fisher Scientific）和100 U/mL青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific）的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM，Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）中培养。MDA-MB-231、4T1、Jurkat E6–1细胞（韩国细胞系库）以及Jurkat T-绿色荧光蛋白（GFP）细胞（System
针对rhTROP2和rmTROP2的纳米抗体的选择和特性鉴定
我们使用一个初始纳米抗体库进行了噬菌体展示生物筛选，以识别与人和小鼠TROP2均发生交叉反应的纳米抗体（图1A）。从最终筛选轮次中随机选择了96个噬菌体克隆，并通过噬菌体ELISA评估了它们对rhTROP2和rmTROP2的反应性。选择了对这两种抗原具有相似结合能力的克隆进行进一步分析（图1B）。
DNA测序鉴定出三种具有不同CDR序列的独特纳米抗体，
讨论
TNBC是一种侵袭性恶性肿瘤，可作用的分子靶点有限，导致治疗选择受限和预后较差[1], [2], [3]。尽管免疫疗法和ADCs改变了治疗格局，但仍需要能够提高肿瘤选择性同时最小化全身毒性的靶向策略。在这项研究中，我们评估了一种通过靶向TROP2（一种在肿瘤细胞中过度表达的细胞表面抗原）来增强rAAV介导的基因传递的策略
CRediT作者贡献声明
Ha Gyeong Shin：写作 - 审阅与编辑，写作 - 原稿撰写，可视化，方法学，研究，正式分析，数据管理。Ha Rim Yang：方法学，研究，正式分析，数据管理。Jae Hyeon Hwang：方法学，研究，数据管理。Hye Rim Cho：方法学，研究，数据管理。Kyusang Hwang：方法学，研究，数据管理。Sukmook Lee：写作 - 审阅与编辑，写作 - 原稿撰写，监督，资源管理，项目管理
资助
本研究得到了韩国政府（科学技术信息通信部）资助的国家研究基金会（NRF）（RS-2026-25481197）的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
Ha Gyeong Shin|Ha Rim Yang|Jae Hyeon Hwang|Hye Rim Cho|Kyusang Hwang|Sukmook Lee
