平衡海藻酸微球的保护性能与渗透性，以增强鼠李糖乳杆菌的循环发酵效果

《International Journal of Biological Macromolecules》：Balancing protection and permeability properties of alginate microspheres to enhance cyclic fermentation of Lactobacillus rhamnosus

　　

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  丝胶能与海藻酸钠形成氢键，从而在不增密的情况下实现高孔隙率和强度。
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  致密的阿拉伯胶-海藻酸钠珠有助于细胞储存，但会阻碍物质扩散，从而降低乳酸产量。
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  酪蛋白-海藻酸钠珠由于细胞泄漏而产量增加，并非真正的固定化效果。
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  载体的性能取决于凝胶网络内的分子相互作用密度和空间排列。

引言

益生菌对宿主健康的有益作用，包括调节肠道微生物群和免疫调节，已得到充分研究[1], [2], [3]。乳酸菌发酵产生的代谢物，如乳酸和细菌素，在食品工业中有广泛应用[4], [5]。其中，鼠李糖乳杆菌因其益生菌特性和功能性应用而被广泛研究。然而，自由状态的益生菌细胞对环境压力非常敏感[6]。鼠李糖乳杆菌 HN001在酸奶、植物基饮料以及发酵水果和蔬菜产品中得到广泛应用，能改善口感、风味、营养价值并延长保质期[7]。然而，自由状态的细胞对低pH值、高温、氧气暴露和机械剪切作用极其敏感，这些因素在发酵、加工、储存和胃肠道传输过程中会显著降低乳酸菌的存活率[8]。此外，使用自由细胞的传统批次发酵需要复杂的细胞-产品分离过程，无法防止噬菌体污染，也不允许细胞重复使用，这些限制降低了整体生产力并增加了运营成本。因此，在生产过程中增强乳酸菌的稳定性是开发稳定功能性食品的重要挑战。

固定化是一种有效的策略，可以提高益生菌的抗压能力并实现可重复的连续发酵[9]。在现有的方法中，天然多糖的离子交联凝胶化技术，特别是基于挤压的海藻酸钠凝胶化技术，因其温和、简单且与细胞相容的特性而特别有吸引力[10], [11]。海藻酸钠（SA）在Ca²⁺交联下形成三维“蛋盒”网络，可以有效包裹细胞[12], [13]。然而，单组分海藻酸钠凝胶网络具有有限的机械强度、不均匀的孔隙形态和对封装细胞的保护不足[14]，这限制了其在高强度处理或长期储存中的应用。此外，虽然这种多孔结构可以保护细胞，但不可避免地会阻碍底物和代谢物等物质的交换，从而产生所谓的“保护-通透性权衡”。克服这一限制并设计出既能提供强大物理屏障又能高效进行物质交换的优化载体，仍是益生菌封装领域中的一个关键科学挑战。

为了解决这一挑战，研究人员通过将次级壁材料混合到海藻酸钠系统中，探索了复合壁基质，从而调节和优化了封装性能。先前的研究表明，海藻酸钠微球与多糖、蛋白质、纳米材料或其他成分结合使用，可以显著提高机械强度、热稳定性和耐受恶劣环境的能力[15], [16]。例如，将SPI加入海藻酸钠中已被证明可以提高植物乳杆菌的封装效率。海藻酸钠-SPI复合系统的凝胶化过程被认为是通过静电复合实现的，Ca²⁺离子中和了静电排斥力，促进了生物聚合物网络中离子桥的形成。由此形成的外层被视为有效的保护屏障，限制了物质向胶囊核心的转移，增强了封装细胞的保护[17]。另一项研究利用丝胶优良的成膜特性和生物相容性开发了载药微球，解决了海藻酸钠载体机械性能不佳的问题[18]。此外，阿拉伯胶（GA）具有良好的成膜和塑性特性，显示出在改善食品质地、封装功能性化合物和控制释放速率方面的巨大潜力。酪蛋白具有多种功能特性，包括结合疏水分子、与其他生物聚合物相互作用、稳定乳液和形成凝胶结构的能力[19], [20]。尽管这些研究取得了进展，但它们仍然较为分散，缺乏对各种天然聚合物（例如蛋白质和多糖）与海藻酸钠之间相互作用的系统性比较研究。特别是，不同壁材料（如亲水性/疏水性、电荷和功能基团）的分子特性如何影响凝胶网络微观结构（例如孔径、交联密度、相分离），进而决定宏观载体性能（例如机械强度、物质传递率和细胞保留率）的机制仍不甚明确。这一机制上的空白限制了益生菌固定化系统的合理设计和优化。

丝胶（SP）是一种天然蛋白质，具有出色的生物相容性和成膜能力，含有丰富的丝氨酸和苏氨酸羟基，能够与细胞壁肽聚糖形成氢键[21]。这些羟基的高密度使其具有与海藻酸钠硫酸软骨素基团的羧基部位形成氢键的潜力[22]。我们假设丝胶会通过二次氢键交联层增强海藻酸钠网络，部分保持孔隙通道，从而将高孔隙率与结构脆弱性分离。然而，现有的研究主要集中在单一丝胶系统中，并未在相同的微胶囊制备条件下系统地与其他天然壁材料进行比较。

因此，本研究选择了鼠李糖乳杆菌 HN001（LR）作为模型菌株，并系统地将海藻酸钠与四种具有不同分子特性的天然壁材料结合：丝胶（SP）、酪蛋白（CN）、大豆蛋白分离物（SPI）和阿拉伯胶（GA）。本研究在相同条件下比较了使用四种天然壁材料制成的海藻酸钠复合微球。通过整合光谱、微观结构和发酵数据，我们研究了壁材料与海藻酸钠之间的分子相互作用如何塑造凝胶网络，以及这些结构特征如何决定细胞保护与底物通透性之间的平衡。本研究的新颖之处在于从平衡结构保护和物质传递的角度，对不同的海藻酸钠基基质进行了比较评估，并将其结构特性与连续批次发酵性能联系起来。本研究为可重复使用的益生菌固定化系统的设计提供了技术和理论指导。

章节片段

材料与试剂

鼠李糖乳杆菌 HN001（LR）来自中国武汉理工大学的食品科学与工程学院实验室。海藻酸钠（食品级，平均分子量Mw约为200 kDa）、大豆蛋白分离物（SPI）和阿拉伯胶从Sigma-Aldrich（美国）购买。丝胶（从丝绸中提取，蛋白质含量>90%）和无机盐（无水氯化钙CaCl₂、葡萄糖）均为分析纯度，来自华润化工。

凝胶珠的物理性质

用于重复使用的益生菌载体必须具有稳定的物理结构、强大的细胞保护能力和持久的代谢活性[29]。本节评估了复合凝胶珠的微观结构、机械性能和水化特性，以明确壁材料组成如何影响凝胶形成，并为后续的封装和发酵性能提供结构基础。

结论

总之，固定化载体的性能不仅取决于壁材料与海藻酸钠之间的分子相互作用密度，还取决于这些相互作用（特别是氢键）在凝胶网络中的空间组织。因此，材料的选择应根据具体应用来确定，而不是寻求适用于所有用途的单一最佳配方。从应用的角度来看，SA-SP复合材料具有开放且……

CRediT作者贡献声明

刘玮瑜：撰写 – 原初稿、验证、方法学、数据分析。王伟：撰写 – 原初稿、软件开发、数据管理。常超：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取。吴金：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源协调、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本工作得到了教育部重点实验室——粮食和油料精深加工创新基金会（编号：2020JYBQGDKFB02）的支持。

刘玮瑜 | 王伟 | 常超 | 吴金