《International Journal of Biological Macromolecules》：Template-dependent RNA polyadenylation by SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase
编辑推荐：
•
SARS-CoV-2 的 RdRp 可以在双链 RNA（dsRNA）的 3′-末端添加 poly(A) 序列。
•
- •
SARS-CoV-2 的 RdRp 可以在双链 RNA（dsRNA）的 3′-末端添加 poly(A) 序列。
- •
这种活性需要引物末端的滑动，并且模板末端会重复复制。
- •
在锰离子存在的情况下，RdRp 可以进行非模板依赖的合成。
- •
RdRp 对 RNA 进行的多聚腺苷酸化（polyadenylation）可以在病毒复制和 mRNA 合成过程中维持 poly(A) 尾巴的存在。
引言
多聚腺苷酸化（polyadenylation）是一种古老的转录后 mRNA 修改过程，几乎存在于所有真核生物中。在细胞 mRNA 的多聚腺苷酸化过程中，poly(A) 泳巴是通过 poly(A) 聚合酶（PAP）非模板依赖性地添加多个腺苷单磷酸（腺苷酸）残基到 RNA 的 3′-末端形成的 [1]。真核生物 mRNA 中 poly(A) 的典型长度约为 70–200 个核苷酸（nt）[2],[3]。poly(A) 泳巴对 mRNA 的功能至关重要，可以调控其翻译效率和稳定性 [4],[5],[6],[7]。与 poly(A) 短化相反的过程称为去腺苷化（deadenylation），它涉及 PAN2–PAN3 复合物启动 poly(A) 泳巴的降解，以及 CCR4-NOT 复合物完成其去除 [8],[9],[10]。这两个过程的平衡使得基因表达能够快速响应细胞信号和病毒感染 [11],[12]。
细胞质 RNA 病毒无法依赖细胞核机制来对其基因组 RNA 或信使 RNA 进行多聚腺苷酸化。然而，现有的实验证据表明 poly(A) 泳巴对病毒的感染性和复制具有关键作用，例如脊髓灰质炎病毒 [13],[14] 或冠状病毒 [15]。为了解决这个问题，细胞质病毒通常直接在其基因组中编码 poly(A) 泳巴，包括甲型流感病毒 [6]、苜蓿花叶病毒 [16]、小RNA病毒 [17],[18]、脊髓灰质炎病毒 [13],[19]、水泡性口炎病毒 [20] 以及冠状病毒 [21],[22]。在复制过程中，这些病毒必须将 poly(A) 泳巴复制到负链中变成 poly(U) 长度，然后利用它来合成含有 poly(A) 的正链。由于负链的合成不一定从 poly(A) 的 3′ 末端开始，再加上细胞质中去腺苷化机制的持续作用，多轮复制可能会导致病毒 RNA 中 poly(A) 泳巴的快速缩短甚至完全丢失 [23]。因此，细胞质病毒发展出了多种策略来维持 poly(A) 泳巴的长度，主要是通过抑制细胞质中的去腺苷化复合物 [7],[12]。
对冠状病毒在细胞培养中的复制研究显示，病毒 mRNA 的 poly(A) 泳巴长度保持稳定，范围在 70–80 个核苷酸左右 [23]。引起 COVID-19 大流行的 SARS-CoV-2 拥有正链 RNA 基因组，其 poly(A) 泳巴仅 33 个核苷酸长 [24]，但转录组分析显示某些亚基因组 RNA 的 poly(A) 泳巴长度要长得多 [25]。值得注意的是，即使 poly(A) 泳巴被截断，病毒在多次传代后也能恢复到正常长度 [26]。此外，在长期感染过程中，冠状病毒的 poly(A) 泳巴长度可能会增加数倍 [21]，这表明可能存在病毒或细胞机制来延长 poly(A) 长度。最近对小鼠肝炎病毒（一种 β-冠状病毒）的研究表明，病毒 RNA 中的 poly(A) 泳巴受到细胞蛋白复合体（PABPC1/CSDE1）的保护，并且可以在病毒复制的细胞质双层膜囊泡中直接延长 [23]。然而，冠状病毒 RNA 的多聚腺苷化分子机制尚不清楚，负责这一过程的酶也尚未被鉴定。
之前有研究表明，病毒 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）可以在某些病毒中促进 poly(A) 长度的延长，要么是在合成正链时在负链的 poly(U) 区域“卡顿”，要么是在 RNA 3′-末端进行非模板依赖的腺苷酸转移 [19],[27],[28],[29],[30]。然而，这些活性尚未在冠状病毒 RdRp 中得到证实。在这里，我们展示了 SARS-CoV-2 的 RdRp 在没有其他因素的情况下 体外 可以以模板依赖的方式延长 poly(A) 泳巴，可能是通过引物 RNA 3′ 末端在负链模板上的“滑动”实现的。这种活性可能在病毒复制和 mRNA 合成中发挥重要作用。
部分摘要
蛋白质表达与纯化
野生型 RdRp 及其两个催化残基 D760A 和 D761A 被替换为 A 的变体按照先前的方法进行了表达和纯化 [31]。简而言之，nsp12 和含有 His6 标签的 nsp7-nsp8 融合物在带有表达载体的 大肠杆菌 BL21(DE3) 中共表达。细胞使用高压连续流式细胞破坏器（Constant Systems Ltd., Daventry, UK）进行裂解。随后通过 Ni 亲和层析和阴离子交换层析步骤进一步纯化 RdRp，
SARS-CoV-2 RdRp 对 RNA 底物的多聚腺苷酸化
为了研究 SARS-CoV-2 RdRp 在 RNA 底物多聚腺苷酸化中的作用，我们使用了一种之前描述的 RNA 底物：该底物由一个 20 个核苷酸长的 5′-Cy5 标记 RNA 引物组成，该引物与一个含有 10 个核苷酸 poly(U) 伸出的 30 个核苷酸 RNA 模板退火（图 1A）。这种 RNA 底物与重组 RdRp（nsp12、nsp7 和 nsp8 子单元的亚复合物）及 ATP 共同孵育不同时间，然后通过变性凝胶电泳分析标记的 RNA 产物。
SARS-CoV-2 拥有已知 RNA 病毒中最长的 RNA 基因组之一，长度接近 30 千个碱基对。与其他冠状病毒类似，它的基因组 3′-末端也包含一个 poly(A) 区段，在复制过程中该区域得以稳定保持。在感染过程中，正链基因组首先被 RdRp 转换为负链，负链的 5′-末端带有 poly(U) 区段，然后作为合成完整长度正链基因组和亚基因组 mRNA 的模板。
Ivan Petushkov: 写作 – 审稿与编辑、可视化、验证、数据分析、概念化。 Andrey Kulbachinskiy: 写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、项目管理、数据分析、概念化。
本研究得到了 库尔恰托夫国家研究中心 的专题计划支持。
作者声明他们没有可能影响本文研究的利益冲突或个人关系。
