《International Journal of Biological Macromolecules》：Cryo-EM structure of a near-planar 13-mer ring formed by recombinant human parainfluenza virus type 2 nucleoprotein
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冷冻电镜（Cryo-EM）揭示了一个近乎平面的重组HPIV2 N 13聚体环，该环与共纯化的RNA共同存在。
• 冷冻电镜（Cryo-EM）揭示了一个近乎平面的重组HPIV2 N 13聚体环，该环与共纯化的RNA共同存在。
• 倾斜采集方式减轻了蛋白质颗粒的优先取向问题，从而实现了C13重建。
• 建模的RNA路径与每个亚基六个核苷酸的排列方式相一致。
• 反复出现的疏水性和极性接触定义了亚基间的相互作用界面。
• MD轨迹显示，在有无模型化poly-U RNA的情况下，环状结构仍然保持不变。
引言 人副流感病毒（HPIVs）是临床上重要的呼吸道病原体，尤其是在婴儿、幼儿、老年人和免疫功能低下的患者中，感染可能从轻微的上呼吸道疾病发展成细支气管炎、肺炎或哮吼[1]。人类副流感病毒2型（HPIV2）的检出频率低于HPIV1和HPIV3，但它仍是导致哮吼和儿童住院的常见原因，属于Orthorubulavirus 属、Paramyxoviridae 科、Rubulavirinae 亚科[2],[3]。这种分类位置使HPIV2与腮腺炎病毒和副流感病毒5型（PIV5）的关系更密切，而非与 respiratoryviruses HPIV1和HPIV3更为接近，这一区别对于理解核蛋白结构和亚基间组织具有重要意义。
与其他副黏病毒一样，HPIV2含有一个不分段的负链RNA基因组，该基因组由病毒核蛋白（N）连续包裹，形成了病毒RNA合成的核衣壳模板[4]。N蛋白必须保护RNA，同时保持有序的组装结构，以便病毒复制机制能够进入。副黏病毒N蛋白具有保守的模块化结构：有序的蛋白质核心形成RNA结合位点，末端区域参与亚基间的组装，而灵活的C末端区域则与其他复制复合体成分相互作用[4]。许多副黏病毒基因组的共同特点是“六核苷酸规则”，即高效的复制与基因组长度为六个核苷酸的倍数有关[5],[6]。相关副黏病毒的结构研究表明，每个N亚基可以容纳六个连续的核苷酸，从而形成重复的RNA结合位点[7],[8],[9]。
PIV5的N-RNA晶体结构对HPIV2尤为重要，因为它揭示了一个由13个亚基组成的正圆病毒环，该环与78个核苷酸相关联，RNA位于N末端和C末端结构域之间的沟槽中[7]。然而，HPIV2的N蛋白与已知的结构同源物之间存在较大的序列差异，仅通过同源性建模可能无法充分确定HPIV2是否保留了相同的RNA结合位点几何结构、臂部排列、亚基间接触或寡聚体结构。此外，来自PIV5、麻疹病毒、尼帕病毒和仙台病毒的实验测定结果表明，一个广泛保守的N蛋白折叠结构可以支持不同的高级组装形式，包括近乎平面的环状结构和角度更大的组装[7],[8],[9],[10],[11],[12]。因此，实验结构信息可以直接作为定义HPIV2 N蛋白结构的依据，而不仅仅是依赖相关副黏病毒的推断。
这些结构信息也适用于将重组HPIV2 N蛋白作为异源表位展示的支架。这样的支架的合理开发需要迭代进行：选择抗原表位时必须考虑其引入载体的结构限制。从免疫学角度精心选择的插入位点可能会改变局部分子结构、表面呈现方式、RNA结合方式、亚基间接触或寡聚体组装，尤其是在结构敏感的区域。相反，识别载体中暴露于表面且结构上允许插入的区域可以指导后续的工程改造。因此，实验确定的HPIV2 N蛋白结构为评估候选插入位点以及区分表位引入引起的效果与N蛋白固有特性提供了必要的结构参考。这一理念促使我们在本研究中开发了重组构建物中的工程化插入位点，而当前的研究主要集中于在插入表位之前确定工程化支架的结构特性，而不是测试其免疫原性。
疏水性排列提供了描述N蛋白内部及亚基间界面局部结构组织的另一种方法。富含异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸残基的网络（本文称为ILV/LIV簇）有助于识别蛋白质核心及亚基间接触表面的疏水区域。比较不同副黏病毒N蛋白的结构有助于描述这些区域的相似性和差异。
本文报道了重组HPIV2 N蛋白与共纯化RNA结合形成的2.91 ?冷冻电镜结构，表现为一个封闭的、近乎平面的13亚基环，并通过分子动力学模拟和比较结构分析进行了补充。该结构明确了HPIV2 N蛋白的核心结构、RNA结合位点、亚基间组织以及整体寡聚体几何形状。这些数据为HPIV2 N蛋白提供了实验性的结构参考，并为后续基于结构的重组支架工程提供了基础。
章节片段 质粒构建、蛋白质表达和纯化 一个合成基因编码了源自人类正圆病毒2型核衣壳蛋白序列（NCBI蛋白质访问码
ARX79648.1 )，该基因经过优化后适合在
大肠杆菌 中表达。在构建过程中，在起始甲硫氨酸之后立即引入了两个甘氨酸残基，并进行了五个限制性位点相关的序列修饰，以便插入表位（补充表S1）。
重组HPIV2 N蛋白形成适合冷冻电镜分析的环状寡聚体 为了获得适合结构分析的可溶性蛋白质，我们系统优化了HPIV2 N蛋白在大肠杆菌 中的重组表达。初步实验表明，在标准诱导条件下，蛋白质主要积聚在不可溶部分。降低IPTG浓度和诱导后的温度，并将诱导时间推迟到OD???为1.0–1.2时，可溶性表达显著提高，这与这些条件下的重组蛋白质产量降低一致。
结论 本研究展示了重组HPIV2 N蛋白形成的封闭的、近乎平面的13亚基环的冷冻电镜结构，基于C13重建，其分辨率由cryoSPARC报告为2.91 ?（受采样限制）。重建和原子模型明确了有序的N蛋白核心、RNA结合位点以及亚基间的结构。沟槽内的密度与保守的副黏病毒RNA结合路径相符，但共纯化的RNA具有异质性。
CRediT作者贡献声明 Zrinka Mati?： 文章撰写——审稿与编辑，初稿撰写，可视化，验证，方法学研究，概念化。 Khan Mohammad Sarim： 可视化，验证，正式分析，数据管理。 Oksana Degtjarik： 方法学研究，调查。 Du?ica Vujaklija： 监督，方法学研究。 Sa?a Kazazi?： 文章撰写——审稿与编辑，初稿撰写，项目管理工作，方法学研究，资金申请，正式分析，数据管理。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明 在准备本文的过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）和Codex来辅助语言编辑、文本组织和格式化，以及Scite来辅助文献搜索和引用检查。作者根据需要审查和编辑了输出内容，并对发表文章的内容负全责。
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢 本工作得到了欧盟 通过欧洲区域发展基金 在“竞争力与凝聚力行动计划”（Competitiveness and Cohesion Operational Programme）下的“RAPTOVAX”项目（项目编号KK.01.1.1.04.0099）的财政支持。冷冻电镜实验的开展得到了iNEXT-Discovery计划（欧盟委员会 资助协议编号871037）的支持，该项目名为“HPIV2核蛋白基纳米粒子的结构表征”（PID 22999）。作者感谢Astbury生物结构实验室的协助。
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