基于光谱–RGB融合与代谢–激素重编程的茶树冷害机制指数构建及高光谱无损预测

《Engineering》：Mechanism-Aware Cold Injury Indexing and Spectral Prediction for High-Throughput Tea Phenotyping

　　

低温胁迫会扰乱膜流动性与蛋白质活性，并促进活性氧（ROS）与丙二醛（MDA）积累，从而造成氧化损伤。植物通过上调超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等酶促抗氧化剂，并积累可溶性糖等相容性溶质以稳定大分子并增强抗寒性，从而维持细胞氧化还原稳态与膜完整性。在代谢层面，低温胁迫诱导抗氧化代谢、渗透调节、膜脂重塑和激素介导信号传导的协同调整。其中，脂质重塑与激素信号对冷驯化尤为重要。以往关于茶树低温胁迫的研究多集中于单一组学数据集或离散生理标记，用以鉴定大量冷响应基因、代谢物和抗氧化酶。然而，由于缺乏连接分子调控网络与可见冷害表型的整合定量指标，这些分子发现难以转化为田间适用的诊断工具。尽管广泛靶向代谢组学能够以高时间分辨率解析动态冷响应，但复杂代谢网络、时间特异性响应模式及破坏性取样方法阻碍了对代谢物–表型相关性的直接解释。光学表型技术能够快速、高通量、无损地监测植物胁迫，为连接外部可见表型与内部生理生化变化提供了可行策略。特别是高光谱成像可捕捉与叶片色素、含水量、组织结构和生化组成相关的特征反射与吸收信号，支持精确的胁迫检测与定量生化预测。红–绿–蓝（RGB）、热成像、荧光和结构成像等互补成像方式可进一步表征植物颜色、温度、形态和质地变化。然而，现有光学表型研究大多主要关注冷害宏观症状或孤立生理指标，尚缺乏阐明多模态光学特征如何反映协调代谢与激素调控的定量框架。因此，该领域仍存在两个突出研究空白：第一，鲜有综合整合定量指标能够系统概括跨生理与多组学层面的协调冷响应特征；第二，茶树缺乏将光学表型信号映射到冷害相关生化变化的标准分析流程。本研究通过整合生理性状、广泛靶向代谢组学和激素谱分析，表征茶树冷响应变化并鉴定与冷害相关的特征，进而将这些分子与生理性状同高光谱和RGB表型相关联，以评估无损光学特征能否反映潜在生化响应。基于与冷害梯度呈一致单调关系的特征，研究人员开发了茶树冷害机制指数（TCMI），将协调冷响应汇总为定量评分，旨在支持冷害无损评估，并为茶树表型鉴定与种质评价提供依据。

茶树（Camellia sinensis）是全球广泛种植和消费的饮料作物之一，具有重要的经济和文化价值。然而，低温胁迫是制约茶树生长和品质的主要非生物胁迫，会导致产量损失和茶叶品质劣变。茶树已进化出缓解冷诱导细胞损伤的生理和代谢策略，因此理解这些响应对于阐明耐寒性和改进茶树低温胁迫评价至关重要。低温胁迫扰乱膜流动性和蛋白质活性，促进活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）积累，导致氧化损伤。植物通过上调超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）等酶促抗氧化剂，并积累可溶性糖等稳定大分子、增强抗冻性的相容性溶质，维持细胞氧化还原稳态和膜完整性。在代谢层面，低温胁迫诱导抗氧化代谢、渗透调节、膜脂重塑和激素介导信号传导的协同调整，其中脂质重塑和激素信号对冷驯化尤为重要。以往茶树低温胁迫研究多集中于单一组学数据集或离散生理标记，鉴定出大量冷响应基因、代谢物和抗氧化酶；然而，由于缺乏连接分子调控网络与可见冷害表型的整合定量指标，这些分子发现难以转化为田间适用诊断工具。尽管广泛靶向代谢组学能以高时间分辨率解析动态冷响应，但复杂代谢网络、时间特异性响应模式和破坏性取样方法阻碍了代谢物–表型相关性的直接解释。光学表型技术可实现快速、高通量、无损的植物胁迫监测，为连接外部可见表型与内部生理生化变化提供可行策略。高光谱成像可捕捉与叶片色素、含水量、组织结构和生化组成相关的特征反射和吸收信号，支持精确胁迫检测和定量生化预测；RGB、热成像、荧光和结构成像等互补成像方式可进一步表征植物颜色、温度、形态和质地变化。然而，现有光学表型研究多关注冷害宏观症状或孤立生理指标，缺乏阐明多模态光学特征如何反映协调代谢和激素调控的定量框架。因此，该领域存在两个突出空白：第一，鲜有综合整合定量指标能系统概括跨生理和多组学层面的协调冷响应特征；第二，茶树缺乏将光学表型信号映射到冷害相关生化变化的标准分析流程。本研究通过整合生理性状、广泛靶向代谢组学和激素谱分析，表征茶树冷响应变化并鉴定与冷害相关的特征；将这些分子和生理性状与高光谱和RGB表型关联，评估无损光学特征能否反映潜在生化响应；基于与冷害梯度呈一致单调关系的特征，开发茶树冷害机制指数（TCMI），将协调冷响应汇总为定量评分。该框架旨在支持冷害无损评估，并为茶树表型鉴定和种质评价提供依据。研究背景方面，茶树低温胁迫是制约其生长与品质的主要非生物胁迫，可导致产量损失和品质劣变；茶树虽已进化出缓解冷诱导细胞损伤的生理和代谢策略，但以往研究多依赖单一组学或离散生理标记，难以将分子发现转化为田间适用诊断工具，且缺乏连接分子调控网络与可见冷害表型的整合定量指标；同时，广泛靶向代谢组学虽具高时间分辨率，但受复杂代谢网络、时间特异性响应模式和破坏性取样限制，难以直接解释代谢物–表型相关性；光学表型技术虽可实现快速、高通量、无损监测，高光谱成像也能捕捉与色素、含水量、组织结构和生化组成相关的信号，但现有研究多关注宏观症状或孤立生理指标，缺乏阐明多模态光学特征如何反映协调代谢和激素调控的定量框架。因此，研究人员开展本研究以填补上述空白。研究人员以耐寒品种龙井43（LJ）和冷敏感品种大面白（DMB）为材料，设置25 °C（对照）、0 °C（轻度低温胁迫）、?5 °C（中度低温胁迫）和?10 °C（重度低温胁迫）四个温度处理，处理6和12 h，对照于0、6和12 h取样；采集高光谱反射（350–2500 nm）和RGB图像，测定抗氧化酶活性与渗透调节物质，开展广泛靶向代谢组学、植物激素定量和KEGG通路注释；基于生理–代谢和激素指标及冷害指数（CDI）构建TCMI，并建立PLSR、SVR和RF回归模型进行TCMI预测，结合VIP和SHAP分析解释光谱特征贡献。研究得出，低温胁迫引起茶树跨层协调重编程而非孤立模态变化，抗氧化过程与激素信号作为耦合调节因子塑造胁迫适应；两个品种表现出以脂质重塑和核苷酸周转为中心的分化冷响应代谢模式；TCMI在所有样本和交叉验证折中表现稳健单调一致性（ρ分别为0.89和0.92），基于150个选定RGB和高光谱特征的PLSR模型在验证集和测试集的R2分别为0.9067和0.9408。该研究为茶树冷胁迫表型分析中多模态数据融合提供了机制依据，展示了TCMI光谱预测框架的生物学和实践价值，为茶树无损耐寒表型鉴定提供了初步机制线索，并有望推广至田间尺度无人机监测和大规模茶树耐寒种质筛选。论文发表在《Engineering》。关键技术方法包括：以耐寒品种龙井43（LJ）和冷敏感品种大面白（DMB）为样本队列，样本来源于中国农业科学院茶叶研究所（杭州，中国）；设置25、0、?5和?10 °C四个温度处理及6和12 h时间梯度；采用FieldSpec 4地物光谱仪采集350–2500 nm高光谱反射，并用数码相机在暗箱中采集RGB图像；测定抗氧化酶活性和渗透调节物质；开展广泛靶向代谢组学（UPLC–MS/MS）和植物激素定量（LC–MS/MS）；进行KEGG通路注释；基于Spearman秩相关、Benjamini–Hochberg FDR校正和Z-score标准化构建TCMI；采用PLSR、SVR和RF建模，并结合VIP和SHAP分析。（忽略试剂和具体培养、质粒构建操作步骤。）

研究结果方面，3.1 茶树低温胁迫下多模态表型响应分析：通过RGB表型指数和高光谱反射表征低温诱导的动态变化，发现LJ在25 °C下多数颜色指数相对稳定，随温度降低波动加剧，归一化色素叶绿素指数（NPCI）和红绿差值指数（RGDI）变化最大；DMB对降温和冷暴露延长响应更强，0 °C时EXG、GBRI、NGBDI和VDVI等绿色度相关指数明显变化，?5 °C时更多指数显著变化；高光谱反射显示LJ在?10 °C下750–1450 nm反射率由0 h的0.55降至12 h的0.40，1450 nm水吸收带由0.35降至0.25，2000–2500 nm由0.32降至0.20；DMB光谱变化更大且更早，?10 °C下750–1450 nm由0.65降至0.48，2200 nm由0.40降至0.28，表明DMB对低温更敏感，尤其在反映组织水分和结构特性的750–1450和2000–2500 nm区域。3.2 抗氧化系统和渗透调节物质的动态响应：通过定量抗氧化酶和渗透相关指标，发现25 °C下多数指标稳定，低温暴露后POD快速诱导，LJ在0 °C 6 h时POD为40 U·g?1，12 h升至110 U·g?1，而DMB在6 h即由40 U·g?1升至180–190 U·g?1，诱导更早；?5和?10 °C下POD一般在6 h达峰，LJ为180–190 U·g?1，DMB在?10 °C达250–260 U·g?1，12 h后下降；SOD在0 °C 6–12 h下降，?5和?10 °C下DMB一般高于LJ；CAT表现品种和温度特异性动态；MDA在更强低温下升高，LJ在?5和?10 °C升高更明显，DMB升高较小且更短暂；LJ可溶性糖总体较高但在?5和?10 °C 6–12 h下降，DMB除?5 °C 12 h明显积累外一般较低；可溶性蛋白在LJ低温下适度增加，DMB在0 °C升高、?10 °C下降；相关矩阵显示CAT与MDA呈中度负相关（r = ?0.44），POD与MDA呈弱正相关（r = 0.35），可溶性糖与抗氧化酶呈弱正相关（r = 0.11–0.30），H?O?与CAT、SOD和POD近零相关（r ≈ 0.01–0.04）。3.3 代谢组学多变量分析：通过广泛靶向代谢组学发现3827种检测代谢物中黄酮类最丰富（23.91%），其次为萜类（12.83%）、酚酸（11.63%）和生物碱（8.02%）；PCA显示PC1（34.9%）区分LJ和DMB，PC2（15.4%）反映低温胁迫强度，?5和?10 °C样本沿PC2明显偏移；LJ在?10 °C聚类紧密，DMB较分散；Venn图显示LJ在25 °C（0 h）vs ?10 °C（12 h）比较中有608个差异积累代谢物（DAMs），DMB为486个，两品种共享364个DAMs，LJ特有244个、DMB特有122个；共享DAMs中脂质最丰富，LJ中脂质占26.97%、萜类18.42%、酚酸11.84%，DMB中脂质占32.90%、萜类15.80%、氨基酸及衍生物9.10%。3.4 代谢组学关键通路富集分析：通过364个共享DAMs聚类热图和KEGG富集分析，发现25和0 °C下两品种代谢波动较小，随温度降低样本间代谢距离增大、品种分歧明显，多数代谢物相对丰度总体上升；亚油酸代谢、核苷酸代谢、嘌呤代谢、α-亚麻酸代谢和植物激素信号转导在两品种中均显著富集；其中植物激素信号转导通路富集因子高达0.6，提示激素代谢在通路调控中作用显著。3.5 茶树低温胁迫下激素响应分析：通过检测8类植物激素（41种化合物），发现细胞分裂素（CK）占36.6%、生长素（auxins）24.4%、茉莉酸（JA）14.6%、水杨酸（SA）9.8%，脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、乙烯（ETH）和独脚金内酯（SL）分别占4.9%、4.9%、2.4%和2.4%；PCA显示PC1（26.6%）区分品种，PC2（21.4%）反映低温诱导的激素重编程，LJ在?10 °C聚类紧密而DMB分散；热图显示LJ和DMB在聚类结构上一定程度分离，IAA、ICA和JA相关模块在诱导强度和时间上存在品种差异；tZRMP在两品种低温下均下降，DMB早至6 h下降而LJ在?10 °C 12 h下降10 ng·g?1；OPDA在25 °C较高，随温度降低和胁迫延长逐渐下降，?10 °C 6和12 h降至检测限以下；SA和IPR总体上升且DMB增幅大于LJ；JA总体较低，仅在?5 °C 6和12 h明显升高，?10 °C保持低水平；SAG在LJ和DMB中基线相对丰度分别约为2000和4000，?10 °C下均骤降至500；IAA在?5和?10 °C下两品种均升高；ICA在DMB的25和0 °C下不可检出，在?5（6 h）和?10 °C出现；GA29在低温处理后出现。3.6 联合富集分析揭示协调代谢–激素响应：通过整合共享DAMs和共享激素数据集的KEGG富集分析，发现代谢组水平上亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢、核苷酸代谢、嘌呤代谢和植物激素信号转导显著富集；激素水平上玉米素生物合成（与IPR相关）、α-亚麻酸代谢、植物激素信号转导、色氨酸代谢、二萜类生物合成、代谢通路和次生代谢物生物合成显著富集；关键代谢物包括AMP、腺苷*、IMP、腺嘌呤、GMP、3'-AMP、尿苷、17-羟基亚麻酸、9(S)-HPOT、9-oxoODE、9(S)-HODE、13(S)-HODE*、9,10,13-TriHOME和JA；与LJ相比，DMB中N6-(1,2-二羧乙基)-AMP、AMP、IMP和腺苷*等嘌呤和核苷酸代谢相关代谢物升高更强，而LJ中3'-AMP、腺嘌呤、尿苷和GMP升高更多；亚油酸代谢中LJ的9(S)-HODE、13(S)-HODE*和9,10,13-TriHOME积累更多且9-oxoODE下降更明显；α-亚麻酸代谢和JA信号相关代谢物在两品种中总体下降，尤其JA；整合结果表明低温胁迫诱导涉及脂质、氧脂素、JA、多种植物激素及核苷酸和嘌呤代谢重编程的保守响应网络，但LJ积累更高水平氧脂素代谢物而DMB嘌呤和核苷酸化合物诱导更强。3.7 TCMI构建及基于光谱的验证：通过将生理指标、代谢物和激素共380个指标与CDI进行Spearman秩相关分析，发现生理指标中可溶性糖和H?O?呈中度正相关（r = 0.25和0.40），CAT活性呈负相关（r = 0.30和0.40）；代谢物形成最大簇，许多呈强正相关（r = 0.60）；激素构成第三个显著正相关簇，以JA（r = 0.65）和SA（r = 0.55）为主；多数代谢物和激素特征q值远低于0.05；PLSR建模显示预测TCMI与相关性加权真值高度一致，校准数据集ρ为0.89、Pearson相关系数（r）为0.83、R2为0.68、RMSE为0.42、MAE为0.36，交叉验证数据集表现几乎相同（ρ = 0.92、r = 0.83、R2 = 0.67、RMSE = 0.43、MAE = 0.39），证实TCMI模型的可靠性和稳定性。3.8 光谱预测因子的机制解释及SHAP对TCMI的贡献：通过SHAP图分析各特征对预测TCMI的贡献，发现RGRI、RGDI和rR的平均绝对SHAP值最高（0.05），较高RGRI和RGDI值主要与正SHAP值相关；rR呈较宽的双侧SHAP分布但总体贡献为正；约2460 nm光谱特征呈正SHAP值，通常与叶片含水量和膜稳定性相关；EXG、R和VARI重要性居中，其高值集中于正SHAP区域；低波长特征（359–400 nm）和部分蓝带变量也贡献正向；在top-150特征子集上，模型验证集R2 = 0.9067、RMSE = 0.2442、MAE = 0.2008，测试集R2 = 0.9408、RMSE = 0.2160、MAE = 0.1590，表明模型在保持强可解释性的同时具有优越泛化能力；基于PLSR模型推导的TCMI预测公式中，RGDI、NPCI和R为正系数，RGRI、EXG和VDVI为负系数。

讨论部分总结：4.1 多模态表型揭示茶树低温胁迫下品种特异性光学和生理响应：多模态融合策略整合RGB成像和高光谱反射捕捉茶树冷胁迫响应，两品种在低温下表现一致分歧响应，LJ颜色指数和光谱轨迹相对稳定，DMB可见性状波动更早且反射率下降更强，表明其叶绿素保持、结构稳定性和光合功能受扰更严重；RGB成像反映下游结果而高光谱信号更接近上游生化变化，二者整合可更完整表征代谢与表型间非线性关系；光学差异与以膜损伤和氧化胁迫调控为中心的阶段性冷响应过程一致，低温先破坏膜完整性和能量代谢，触发膜脂重塑和氧化还原失衡，POD快速诱导可能对应早期过氧化物解毒和细胞结构稳定，CAT延迟升高及其与MDA负相关提示早期氧化爆发与后续膜修复间的潜在时间分离；SOD和可溶性糖下降暗示光合受限下碳利用从储存向呼吸和维持代谢重分配。4.2 代谢–激素重编程是冷驯化基础并区分品种策略：整合代谢组和植物激素分析揭示涉及亚油酸和α-亚麻酸代谢、嘌呤和核苷酸代谢及植物激素相关通路的保守冷响应网络，形成连接膜脂重塑、氧脂素信号、核苷酸周转和激素调整的协调调控系统；HODEs、TriHOME、9-oxoODE和茉莉酸相关中间体等脂质衍生代谢物可能反映膜脂肪酸周转和胁迫信号分子生成；AMP、IMP、GMP、腺苷*等变化表明核苷酸池大幅重组，可能支持能量周转、代谢调整和细胞修复；低温触发JA、SA、CK、IAA和GA同步变化，表明冷驯化可能依赖多种激素信号协调波动而非单一激素通路；α-亚麻酸代谢和激素信号转导通路富集支持脂质衍生JA信号在该网络中的重要作用；但多种激素相关组分总体下降表明低温也可能减弱或负调控部分激素响应系统；防御代谢物与生长相关激素在冷胁迫加剧下的相反趋势提示胁迫防御与营养生长稳态间潜在权衡；两品种共享主要响应通路但相对代谢重点不同，LJ氧脂素相关代谢物变化更大，提示亚油酸衍生氧脂素代谢和下游脂质重塑更强，可能部分解释其优越耐寒性；DMB嘌呤和核苷酸代谢物诱导更强而LJ中GMP、3'-AMP、腺嘌呤和尿苷积累更明显，表明核苷酸池再分配程度不同；总体表明茶树冷响应依赖连接脂质、氧脂素、JA和多种激素的保守网络，并通过嘌呤和核苷酸代谢维持，LJ更侧重氧脂素相关脂质重塑而DMB表现更强核苷酸和嘌呤代谢重编程。4.3 TCMI连接多层生化响应与光学表型用于无损评估：本研究显著优势在于将多层生物过程与相应光谱特征进行统计关联，提供内部生化状态与外部表型间可解释联系；低温下750–1450、1480–1800和2000–2500 nm区域反射率明显下降，分别与O–H、C–H和N–H官能团吸收相关，间接反映水、脂质和蛋白质变化；这些光谱变化与脂质和核苷酸代谢重编程具统计相关性，表明近红外反射信号可作为与膜重塑相关的叶片生化和结构改变的关联读数；可见光区EXG、VARI和RGDI等绿色相关指数下降及红色反射增强与POD和CAT活性升高时期吻合，可能反映叶绿素相关结构和氧化还原调整；成像性状时间变化与激素谱变化相关，JA和SA主导阶段与较暗外观和较低反射率相关，IAA、CK和GA相关恢复与绿色度和反射率增加相关；光谱和成像信号仅提供关联读数以间接反映跨膜重塑、JA介导信号及后续抗氧化和渗透调节的冷胁迫级联；本研究核心创新是建立多层代谢/生理响应（整合为TCMI）与叶片RGB/高光谱表型特征间统计联系，相比主要依赖经验指数或黑箱分类器的传统高光谱方法，TCMI光谱框架在代谢通路重编程、叶片生化和光谱表型间建立生物学可解释的统计关联。

结论部分翻译：本研究为茶树冷胁迫表型分析中多模态数据融合提供了机制依据，并证明TCMI光谱预测框架的生物学和实践价值。RGB成像、高光谱表型、代谢组学和植物激素谱分析的整合揭示，低温胁迫引发跨层协调重编程而非孤立模态特异性变化；抗氧化过程和激素信号作为耦合调节因子塑造胁迫适应，两个受试茶树品种表现出以脂质重塑和核苷酸周转为中心的分化冷响应代谢模式，可能构成不同冷适应表型的基础。本研究开发了机制整合的光学–代谢组学分析框架，用于受控低温处理下冷胁迫定量评价。在所测试冷胁迫梯度内，光谱特征与代谢和激素调控网络一致相关，表明光学信号可作为叶片内部生化状态的可解释关联指标。TCMI在所有样本和交叉验证折中表现稳健单调一致性，ρ分别为0.89和0.92；基于150个选定RGB和高光谱特征的PLSR模型预测TCMI，验证集和测试集R2分别为0.9067和0.9408。总体而言，研究结果为多模态成像用于茶树无损耐寒表型鉴定提供了初步机制线索。未来工作将把该多模态表型框架扩展至田间尺度无人机监测和大规模茶树耐寒种质筛选，从而促进耐寒茶树品种选育和茶园冻害精准预警。