整合蛋白质组学与转录组学揭示海鞘变态发育的分子基础

《Marine Life Science & Technology》：Integrated proteomics and transcriptomics provide insights into molecular basis of ascidian metamorphosis

浅水海鞘是一种入侵性污损海洋生物，能够快速从浮游幼虫变态为固着形态。为了深入了解其环境适应性并开发有效的生物污损控制方法，探索变态过程的分子与细胞调控机制至关重要。本研究采用四维无标记定量蛋白质组学（4D label-free quantitative proteomics）结合转录组学（transcriptomics），监测了海鞘Ciona在五个胚后发育阶段的蛋白质与基因表达变化。研究人员共鉴定到6043种蛋白质。蛋白质与基因表达的时序动态变化，以及差异表达蛋白（DEPs）和差异表达基因（DEGs），揭示了与变态相关的生物学过程。研究人员重点关注了可能参与早期变态的磷酸肌酸生物合成与蛋白质分泌，以及涉及幼体生理调控的纤毛组装/运动。研究发现，几种特异性表达于幼虫尾部肌肉的肌酸激酶（creatine kinases）在变态前显著上调，而磷酸肌酸处理可显著提高ATP水平并加速尾部退化，表明磷酸肌酸穿梭系统（phosphocreatine shuttle system）参与了变态的启动。在变态前期上调的分泌蛋白和胞外基质蛋白（extracellular matrix proteins）被证实由多种组织表达，包括神经系统、脊索和表皮；抑制蛋白质分泌途径可有效降低幼虫附着和尾部退化的比例，突显了胞外蛋白在幼虫定居和变态中的重要性。此外，幼体多个组织/器官中存在系统性纤毛结构，进一步支持了纤毛组装/运动在幼体生理调控中的关键作用。总体而言，该研究为探究海鞘变态提供了宝贵的资源，并有助于更深入理解其分子基础。

研究背景与科学问题

海鞘是一类重要的海洋无脊椎动物，属于脊索动物门，与脊椎动物亲缘关系最近。某些浅水海鞘（如Ciona属、Styela属和Botryllus属）是典型的入侵性和污损性生物，它们大量附着于海上平台、船舶和水产养殖设施等水下结构物，造成严重的经济和环境问题。例如，在温带贝类养殖中，海鞘在污损群落中的占比可超过80%，每年因污损生物造成的经济损失估计高达15至30亿美元。海鞘的生活史包括自由游泳的幼虫阶段和固着的成体阶段，从幼虫向成体的转变过程称为变态。这一短暂但关键的过渡期对于海鞘的成功定殖和种群扩张至关重要，涉及形态、生理、生化、行为和生态等多个层面的剧烈协同变化。尽管已有研究揭示了多种神经信号分子（如GABA、肾上腺素、多巴胺、促性腺激素释放激素等）在诱导海鞘变态中的作用，但目前仍不清楚这些信号通路如何相互协调，以及是否存在来自其他组织器官的独立于神经系统的信号分子参与变态启动。此外，与尾部退化过程相比，变态中后期（如幼虫体轴旋转和幼体组织器官形成）的调控机制研究相对不足。蛋白质组学作为一种强大的手段，可以克服单纯依赖转录组学推断基因活性的局限性，因为mRNA与蛋白质水平之间存在不一致性。然而，此前尚未有研究对海鞘变态过程进行系统的蛋白质组学分析，更缺乏蛋白质与基因表达谱的整合研究。

研究内容与结论

为填补上述空白，研究人员利用四维无标记定量蛋白质组学（4D label-free quantitative proteomics）联合转录组学（transcriptomics），系统追踪了海鞘Ciona savignyi从自由游泳幼虫期到幼体期的蛋白质和基因表达图谱。研究覆盖了五个胚后发育阶段：孵化游泳幼虫早期（HSL1）、孵化游泳幼虫晚期（HSL2）、尾部退化幼虫期（TRL）、变态幼虫期（ML）和中幼体期（MJ）。通过分析蛋白质和mRNA表达的时序动态以及差异表达蛋白（DEPs）和差异表达基因（DEGs），研究人员发现磷酸肌酸生物合成、蛋白质分泌（来自不同组织的胞外蛋白）、纤毛组装/运动和谷胱甘肽代谢等生物学过程参与了变态或幼体生理调控。该整合组学景观为研究海鞘变态提供了宝贵资源，并加深了对海洋无脊椎动物环境适应分子基础的理解。

主要关键技术方法

1. 1.
   样本采集与实验设计：研究人员在中国青岛沿海采集成年C. savignyi，收集卵子和精子进行人工受精，在18°C下培养胚胎。在五个胚后发育阶段（HSL1、HSL2、TRL、ML、MJ）分别收集约1000个（蛋白质样品）或200个（RNA样品）幼虫或幼体，每个时间点设置三个生物学重复。
2. 2.
   蛋白质组学分析：采用四维无标记定量液相色谱-串联质谱法（4D label-free LC-MS/MS）进行蛋白质鉴定和定量，数据使用Proteome Discoverer搜索引擎处理，针对C. savignyi基因组注释数据库进行搜索。
3. 3.
   转录组学分析：使用TRIzol试剂提取总RNA，构建cDNA文库后在Illumina NovaSeq 6000平台上进行PE150双端测序，基因表达水平通过kallisto软件进行伪比对定量并以TPM（每百万转录本数）标准化。
4. 4.
   功能验证实验：包括磷酸肌酸处理实验（检测ATP水平和尾部退化率）、布雷菲德菌素A（BFA）处理实验（抑制蛋白质分泌以观察幼虫附着和尾部退化）、转基因启动子-报告基因电穿孔实验（检测特定基因的组织表达模式）、全胚原位杂交（检测纤毛相关基因的表达分布）、免疫荧光染色（抗乙酰化-α-微管蛋白抗体标记纤毛结构）以及激光共聚焦显微镜成像。

研究结果

整合蛋白质组学与转录组学分析海鞘变态

研究人员共鉴定到6043种蛋白质和13,672个基因。主成分分析显示各发育阶段的生物学重复紧密聚集，不同阶段间明显分离，其中MJ阶段与其他阶段分离最远，表明该转变期发生了剧烈的蛋白质和基因表达重塑。蛋白质与mRNA之间的整体Pearson相关系数均值为0.106，57.3%为正相关。GO富集分析发现，胞外基质-受体相互作用、细胞粘附和多种代谢通路在正相关蛋白-mRNA对中显著富集，而能量产生和激素相关通路在负相关对中富集。MJ阶段特有271种蛋白质，约占鉴定蛋白的4.69%，富集于蛋白水解、神经元凋亡和细胞骨架组织调控等过程。

发育阶段蛋白质和mRNA表达的时序动态

通过模糊C均值聚类，蛋白质和mRNA各自聚为七个簇。下调的蛋白簇（簇2、3、4）涉及肌动蛋白聚合调控、三羧酸循环和蛋白质折叠等功能。簇1蛋白在变态前期和早期高表达，富集于磷酸肌酸生物合成、翻译和蛋白质运输。簇6和簇7蛋白在MJ阶段高表达，显著富集于谷胱甘肽代谢和纤毛组装/运动等过程。k-means共聚类分析进一步确认了这些趋势，其中簇1（蛋白和mRNA均上调）同样富集于纤毛相关过程和谷胱甘肽代谢。

相邻阶段间的差异表达蛋白和基因分析

四个相邻阶段比较中共鉴定到大量DEPs和DEGs，其中MJ vs. ML的比较中差异数量最多（905个上调、729个下调蛋白；2567个上调、1865个下调基因）。DEPs和DEGs的相关性在MJ vs. ML比较中最高。GO富集分析再次确认了磷酸肌酸生物合成、翻译、中间丝/肌动蛋白丝组织、谷胱甘肽代谢和纤毛组装等生物学过程的重要性。

磷酸肌酸穿梭系统为变态早期提供能量来源

四种肌酸激酶（CKs）（Cs-KCRS、两种Cs-KCRT、Cs-KCRB）在变态前期和早期蛋白强度较高。转基因报告基因实验证实这些CKs特异性地表达于幼虫尾部肌肉。磷酸肌酸处理实验显示，在HSL2阶段添加磷酸肌酸可剂量依赖性地加速幼虫尾部退化，并在3小时处理后效果显著，同时细胞内ATP水平显著升高，表明磷酸肌酸穿梭系统可为变态启动提供直接能量。

蛋白质分泌是幼虫附着和尾部退化所必需的

在变态前期上调的DEPs中，胞外蛋白的比例较高（约20%）。三种感兴趣的蛋白（POIs）——Cs-GnRH1（促性腺激素释放激素前体）、Cs-MSMB-like（β-微精蛋白样胞外蛋白）和Cs-LYAM3-like（含VWFA和Sushi结构域的胞外基质蛋白）——在变态前期显著上调。转基因报告基因实验显示，Cs-GnRH1分布于神经系统（乳头神经元、吻侧躯干表皮神经元、脑泡、运动神经节和神经索），Cs-MSMB-like定位于脊索细胞，Cs-LYAM3-like表达于幼虫躯干表皮细胞。使用布雷菲德菌素A（BFA）阻断蛋白质分泌后，幼虫尾部退化和附着均被显著抑制，证实了胞外蛋白在幼虫定居和变态中的必要性。

系统性纤毛系统参与幼体的感觉感知和循环驱动

免疫荧光染色显示，变态后幼体全身拥有发达的纤毛系统，分布于鳃囊、胃肠道、内柱和感光细胞等多种组织和器官。蛋白-蛋白互作网络分析鉴定了10个核心纤毛相关蛋白，包括多种鞭毛内转运蛋白（IFTs）、放射辐状头部蛋白同源物（RSPHs）、纤毛和鞭毛相关蛋白（CFA53）以及TEKT2。原位杂交进一步证实了代表性纤毛基因Cs-IFT172和Cs-RSH4A在幼体感觉和消化吸收相关组织中的表达分布。

讨论与结论

本研究的蛋白质组学分析共检测到6043种蛋白质，其中6028种与转录组数据匹配，占RNA-seq捕获表达基因的44.1%。这一蛋白数目约为先前脊索组织蛋白质组学研究的两倍，与C. robusta胚胎发育蛋白质组学研究的7095种蛋白相当。通过对海鞘变态过程中蛋白质和基因表达的系统性整合分析，研究人员揭示了磷酸肌酸生物合成、蛋白质分泌和纤毛组装/运动等关键生物学过程在变态启动和幼体生理调控中的重要作用。具体结论如下：1）磷酸肌酸穿梭系统通过尾部肌肉特异性表达的肌酸激酶为变态启动提供直接能量来源；2）来自神经系统、脊索和表皮等多种组织的胞外蛋白协同参与幼虫附着和尾部退化过程；3）幼体体内广泛分布的纤毛系统在感觉感知和消化吸收等生理功能中发挥关键作用。这些发现不仅为理解海鞘变态的分子机制提供了重要资源，也为开发针对关键靶点的海洋生物污损防控策略奠定了理论基础。