基于70份浙江常规粳稻全基因组重测序揭示遗传多样性与选择信号以支撑精准育种

《Molecular Genetics and Genomics》：Unraveling genetic diversity and selection signatures in rice: insights from whole-genome resequencing for precision breeding

水稻育种在筛选兼具高产、广适性与耐逆性的潜力材料方面面临诸多挑战。本研究对来自浙江省的70份常规粳稻（japonica rice）品种进行基因组测序，以评估其遗传多样性，并为未来水稻育种工作提供基因组学支撑。全基因组重测序（whole-genome resequencing）技术是阐明遗传多样性、解析群体结构（population structure）及探究水稻种质适应性进化的有效工具，可为推进分子育种（molecular breeding）提供重要启示。为提升粳稻遗传资源的利用效率并促进新品种选育，研究人员对中国浙江省来源的70份粳稻材料的遗传数据开展了全基因组重测序分析。研究人员通过系统发育树构建、主成分分析（PCA）和选择消除分析（selective sweep analysis），系统研究了遗传多样性、群体结构与选择信号（selection signatures）。研究结果显示，该地区常规粳稻品种具有丰富的遗传多样性，群体明显分层为两个遗传上存在分化的亚群。通过选择消除分析，共鉴定出112个在育种过程中受到选择压力的基因组区域。随后对上述选择区域内候选基因进行的KEGG与GO富集分析，为后续基因功能研究奠定了基础。此外，单倍型分析（haplotype analysis）进一步揭示了与农艺性状显著相关的等位变异，为水稻品种改良提供了有价值的遗传信息。本研究为精准育种（precision breeding）奠定了坚实的基因组学基础，并为优化改良粳稻品种的选育提供了可操作的见解。研究结果揭示了浙江粳稻品种中存在两个遗传上明显不同的亚群，其多样性水平差异反映了各自的育种历史。研究人员鉴定出多个可能经历了选择的基因组区域与候选基因。上述结果为今后更有针对性地利用浙江粳稻种质资源开展育种工作提供了基因组学依据。

水稻（Oryza sativa L.）是全球约三分之一人口的主要粮食作物，随着人口持续增长，实现高产、广适与稳产已成为农业生产的关键目标，同时提升非生物逆境抗性对保障全球粮食安全至关重要。种质资源的收集、筛选与研究在发掘和利用抗逆、高产与广适遗传特性方面具有关键作用，但针对浙江常规粳稻品种遗传多样性的研究仍相对较少。分子育种在水稻育种史上是种质资源创制、发掘与利用的核心工具，半矮秆种质及其相关基因在第一次绿色革命中显著提升了产量稳定性，海南野生稻雄性不育系的发现奠定了杂交水稻体系的基础，超级杂交稻分子设计模型等进展进一步突破了产量上限，凸显了发掘和利用优良种质的重要价值。目前全基因组重测序技术已广泛应用于水稻遗传多样性与群体遗传学研究，Wang等对3010份亚洲栽培稻的分析鉴定出与耐逆、抗病和产量相关的关键基因，Higgins等对672份越南地方稻的重测序揭示了亚群间显著遗传分化，Kim等对KRICE_CORE种质重测序揭示了丰富的遗传多样性，Han等对杂草稻的分析鉴定出包括耐旱基因PAPH1在内的选择区域，Jiang等对126份种质重测序构建了抗逆变异图谱并鉴定出耐旱关键候选基因AIM1。全基因组重测序也推动了参考基因组的发展，IRGSP于2005年发布了首个基于图谱的日本晴粳稻参考基因组，长读长测序技术进一步实现了日本晴端粒到端粒（T2T）无间隙组装，但单一静态参考基因组难以全面反映物种内的大片段结构变异（SVs）与存在-缺失变异（PAVs），因此研究人员通过整合多个基因组构建了泛基因组（pan-genome），Shang等基于251份材料的图泛基因组揭示了广泛的SVs及其与粒重、耐淹和株型的关联，Guo等组装了145份野生与栽培稻的高分辨率泛基因组并鉴定出众多抗病与环境适应相关的野生稻特有基因。2016—2020年间浙江注册常规粳稻品种表现出显著产量优势且种植面积逐年增加，2020年新注册品种占常规粳稻总种植面积的59.04%，在保持产量水平的同时对品质、抗病性和株型提出了更高要求，而该地区种质资源研究有限，因此有必要对浙江常规粳稻品种开展系统研究。本研究采用全基因组重测序分析70份浙江常规粳稻材料的遗传多样性、群体结构与适应性进化，为高效利用水稻种质资源和选育新品种提供依据。

研究人员于2023年在嘉兴海宁和杭州富阳种植70份来自浙江省各育种机构的常规粳稻材料，每份材料单区种植、三次重复、随机完全区组设计（RCBD），每区15行、每行7株、共105株，株行距20 cm×20 cm，肥水管理与当地生产一致；每区随机选取5株、共三个重复区15株采集表型数据，考察全生育期（d）、有效穗数、株高（cm）、每穗粒数、结实率（%）和千粒重（g）。分蘖期叶片DNA按常规方法提取，随机打断为350 bp片段构建文库，在Illumina平台测序，平均测序深度15.65×。使用Fastp过滤原始数据，Sentieon软件比对粳稻参考基因组MSU7.0，Samtools排序去重，GATK的UnifiedGenotyper模块检测单核苷酸多态性（SNP）和插入缺失（InDel），并按QD<5.0、FS>50.0、SOR>3.0、MQ<50.0、MQRankSum3.5过滤；再用PLINK剔除偏离哈迪-温伯格平衡（P<0.000001）、次等位基因频率（MAF）低于5%及检出率低于90%的SNP，并与从SNP-Seek下载的404 K核心SNP数据集比较。基于SNP采用邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树并用ITOL可视化，PLINK估算遗传距离，R 4.4.5统计分析。用PLINK进行主成分分析（PCA）并以ggplot2可视化，Admixture计算K=2~8的群体结构、迭代10000次，pophelper确定最优K值。用VCFtools计算核苷酸多样性（π）、Tajima's D和Fst，GeneHapR对OsWD40和OsDEP2等关键农艺基因进行单倍型推断并用haplo-score函数分析单倍型-表型关联。选择消除分析以Fst最大值前1%及两群体π比值最大值或最小值前1%为阈值，同时落入两区间的区域定义为潜在选择区域，区域内基因定义为候选基因。对候选基因用R 4.4.5进行GO与KEGG富集分析，注释来自Ensembl Plants（release 62）的IRGSP-1.0注释文件，背景为参考基因组全部蛋白编码基因，采用Fisher精确检验，P<0.05为显著富集。

结果部分：重测序数据分析与比较方面，70份材料双端测序产生279 GB原始数据，质控后获273.3 GB可用数据，平均Q30为95.11%，平均比对率98.56%，平均深度15.65×；snpEff注释显示SNP基因组分布不均，多数位于基因间区和基因侧翼调控区，蛋白编码外显子变异410623个（9.1%），剪接区16592个（0.4%），非翻译区合计1.7%，内含子区405784个（9.0%）；SNP密度热图显示SNP位点聚集于第6和第11号染色体特定区域；与404 K数据集中GJ-tmp和GJ-sbtrp亚群比较，共享SNP 775622个，70份浙江材料含特有SNP 1334994个、占63.3%，表明这批重测序数据具有重要研究价值。表型分析方面，70份材料6个农艺性状变异丰富，全生育期集中在155~160 d、均值149.64 d、变异系数（CV）7.45%；有效穗数集中在18万~20万、均值19.51万、CV 7.13%；株高集中在98~105 cm、均值99.15 cm、CV 7.36%；每穗粒数集中在120~130、均值123.6、CV 12.32%；穗长集中在16~19 cm、均值17.30 cm、最大23.96 cm、CV 10.76%；千粒重集中在25~26 g、均值25.69 g、CV 4.96%。结构分析方面，系统发育树将浙江常规粳稻分为两个亚群并呈层次结构，PCA的PC1和PC2解释了主要遗传变异并将材料分为两组，第1组（G1）聚类紧密提示遗传背景相近、可能源自现代高产或优质品种，第2组（G2）分布分散提示保留了地方品种或过渡育种材料的遗传多样性；群体结构分析以K=2为最优祖先群体数，部分样本存在混合祖源成分，提示亚群间历史基因流，可能源于育种中的杂交或种质交换；IBS遗传距离矩阵显示多数品种间遗传距离较小、少数样本距离较大，可能为地方品种或具独特遗传背景的杂交种。群体选择分析方面，G1总体平均π值为1.14×10^?3，低于G2的1.37×10^?3，表明G2遗传多样性更高；高核苷酸多样性区域集中于第4和第10号染色体；Tajima's D分析中G1第7和第8号染色体呈高正值提示平衡选择，负值区域提示正选择或瓶颈效应，G1负值位点多于G2，说明G1经历更强正选择；G2的Tajima's D波动更大，第1和第5号染色体显著负值提示较强选择压力或突变事件。Fst分析方面，G1与G2间第1、3、7、10号染色体存在高Fst值（>0.3），提示这些区域遗传分化显著、可能受不同选择压力并与产量或抗病等重要农艺性状基因相关；第5、9、11号染色体Fst值较低，提示两群体在这些区域遗传背景相似。选择消除分析方面，研究在G1中鉴定出112个潜在选择区域和249个强选择候选基因，主要分布于第3、7、8、10号染色体，与G1这些区域Tajima's D值（OsWD40（Os07g0660700）在第4、5、6外显子各存在一个单核苷酸错义突变，分为OsWD40^Hap.1（48份）和OsWD40^Hap.2（11份），OsWD40^Hap.1全生育期长于OsWD40^Hap.2，而OsWD40^Hap.2穗长显著高于OsWD40^Hap.1，提示OsWD40^Hap.2在促进穗长方面具潜在优势并可能参与调控全生育期；OsDPE2（Os07g0662900）在第1和第15外显子各存在一个单核苷酸错义突变（为同义替换），分为OsDPE2^Hap.1、OsDPE2^Hap.2和OsDPE2^Hap.3，OsDPE2^Hap.1与OsDPE2^Hap.3间、OsDPE2^Hap.2与OsDPE2^Hap.3间每穗粒数差异显著，OsDPE2^Hap.3每穗粒数多于OsDPE2^Hap.1和OsDPE2^Hap.2，提示OsDPE2^Hap.3可能是控制每穗粒数的有利单倍型；OsDPE2^Hap.2穗长显著高于OsDPE2^Hap.1，其余组合间无显著差异，提示OsDPE2^Hap.2可能是与穗长相关的单倍型。

讨论部分指出，水稻遗传多样性是其适应不同生态环境、抗病虫和提高产量的基础，研究群体遗传结构可为合理利用种质资源提供科学依据。本研究基于70份浙江代表性高产常规粳稻品种的全基因组重测序数据，阐明了该地区常规粳稻的遗传多样性、选择压力和遗传分化特征；与3KRG数据库比较鉴定出1334994个特有SNP；系统发育树和PCA将材料分为G1和G2两个亚群，多数品种遗传相似度较高，可能与现代育种中优良品种的广泛推广和特定基因型的集中选择有关，少数样本遗传距离较大可能反映地方或杂交品种的独特遗传背景；结构分析确认两个亚群存在并在部分样本中发现混合祖源成分，提示育种过程中可能发生基因流或杂交事件，也可能与地理分化有关，G2种质主要来自长江三角洲中部的杭州和嘉兴，G1主要分布于长江三角洲南部，与以往报道的中国水稻群体区域多样性一致。核苷酸多样性分析显示G2遗传多样性显著高于G1，可能因G2在育种中经历的选择压力较小而保留更多遗传变异，较高多样性意味着更强的环境变化与病虫压力适应能力并可保存耐逆改良的有价值遗传资源；G1多样性较低源于更强的选择压力，现代育种对高产或抗病等特定性状的强选择倾向于固定某些等位基因，这种遗传瓶颈效应在集约化育种中较为典型。Tajima's D分析揭示可能经历平衡选择的基因组区域，正选择常体现在高产或抗病等性状上，G2在第1和第5号染色体等区域呈负Tajima's D值提示正选择；Fst分析显示G1与G2在第2、7、9号染色体存在显著遗传分化，这些区域与不同环境条件下产量、抗病和耐旱性状的选择压力差异相关，高Fst区域与重要农艺性状基因连锁，提示这些基因可能是育种过程中的关键靶标，而第5和第10号染色体较低Fst值提示两群体在这些区域遗传背景相似，通常反映未经历显著选择压力或群体间存在基因流。整合Fst与π比值分析在G1中鉴定出112个选择区域、含249个候选基因，GO富集显示这些基因显著富集于有机物质运输和氮化合物代谢通路，与高产性状直接相关，例如Ghd7作为氮利用效率负调控因子ARE1的上游基因正向调控氮利用与产量；KEGG富集的剪接体通路可能与转录因子在植物抗逆中的作用有关，如OsSCR106编码含RNA识别基序和富含丝氨酸/精氨酸（SR）二肽的剪接因子，敲除后突变体耐盐性降低，说明剪接因子在水稻抗逆中的作用。单倍型分析可更好指导水稻育种，如NAL1的单倍型分析证明其对穗数、每穗粒数和产量的显著效应并鉴定出增产的优良单倍型；本研究的单倍型-表型关联分析鉴定出OsWD40和OsDPE2的有利单倍型，其单倍型特异标记可用于靶向穗长与全生育期（OsWD40）以及每穗粒数与穗长（OsDPE2）的分子标记辅助选择（MAS），所鉴定的SNP位点可用于开发KASP标记进行精准双等位基因分型，系统聚合这些已验证单倍型可提高性状可预测性与育种效率。研究同时指出局限性：仅纳入70份浙江常规粳稻材料，未来需扩大样本量和地理分布加以验证；Tajima's D和Fst虽能识别受选择压力和遗传分化的区域，但仍需功能验证实验确认这些区域基因对表型的具体贡献，未来应聚焦高Fst区域的功能基因挖掘，尤其是与抗病、耐逆和产量相关的基因。

研究结论：对70份浙江常规粳稻材料的全基因组重测序揭示了明显的遗传分层，分为G1和G2两个亚群，G2核苷酸多样性更高，提示保留了祖先遗传变异，而G1多样性降低可能源于针对高产性状的选择育种；第1、3、7、10号染色体上的关键基因组区域存在显著分化，可能携带对农艺适应性至关重要的基因；单倍型分析鉴定出OsWD40和OsDPE2中与穗长、全生育期和每穗粒数相关的有利单倍型，经进一步验证后可作为精准育种的潜在标记。这些发现为优化浙江粳稻改良策略奠定了基因组学基础，并凸显了利用区域种质多样性的价值。尽管本研究聚焦于70份浙江常规粳稻品种，但所选材料为从省级育种机构系统收集的代表性高产品种，含有区别于3KRG数据库的独特SNP位点，其群体结构与遗传多样性分析为理解浙江水稻遗传架构提供了可靠见解；但这些发现对浙江以外地区的适用性仍需通过扩大种质取样和跨区域表型评价进一步验证，未来研究可结合本研究的群体遗传分析结果，进一步开展功能基因挖掘与应用研究，为精准水稻育种和品种创新提供更丰富的资源与理论支撑。