基于 Smurf1-Mfn2-AMPK 轴调控的椎间盘软骨终板钙化机制及纳米治疗策略：共递送 Mfn2 mRNA 与 Smurf1 靶向 PROTAC 研究

《Journal of Nanobiotechnology》：Mechanistic study of Lip@ZIF-8(Mfn2/SMART1)-mediated ubiquitination regulation in restoring mitochondrial homeostasis and inhibiting cartilage endplate calcification

摘要

目的

本研究旨在阐明SMAD泛素调节因子1（Smurf1）介导的mitofusin 2（Mfn2）的泛素化及其降解导致线粒体稳态失衡以及椎间盘退化（IVDD）中软骨终板（CEP）渐进性钙化的分子机制，并评估构建的pH响应性PEG化脂质包覆沸石咪唑框架-8（ZIF-8）纳米颗粒（同时递送Mfn2 mRNA和针对Smurf1的PROTAC，命名为SMART1，即Lip@ZIF-8(Mfn2/SMART1））在重建Smurf1-Mfn2-AMP激活蛋白激酶（AMPK）-自噬轴和抑制CEP钙化方面的治疗潜力。

方法

首先通过椎间盘穿刺建立大鼠IVDD模型，然后从假手术组和IVDD组收集CEP组织进行蛋白质组学和代谢组学分析。结合基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集、代谢途径分析以及构建的蛋白质组学-代谢组学网络，来描绘Smurf1-Mfn2-AMPK-线粒体代谢调控网络的整体失调情况。在此基础上，对IVDD组和Lip@ZIF-8(Mfn2/SMART1)处理组的CEP组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），以评估该治疗对CEP细胞状态的系统性重塑作用。为了进行机制研究，分离并培养了原代CEP细胞和293T细胞，并建立了β-甘油磷酸（β-GP）诱导的类似成骨的CEP细胞钙化模型。应用慢病毒介导的Mfn2过表达、SMART1处理和AMPK抑制剂干预，系统评估Smurf1-Mfn2-AMPK-自噬轴在钙化调控中的功能性作用。进一步通过共免疫沉淀（Co-IP）、谷胱甘肽S转移酶（GST） pull-down测定和体外重组泛素化反应来验证Smurf1介导的Mfn2泛素化和降解的分子机制。在功能实验中，综合使用了碱性磷酸酶（ALP）和茜素红染色、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、Western blot（WB）、JC-1线粒体膜电位测定、透射电子显微镜（TEM）和mCherry-GFP-LC3双荧光追踪技术来评估线粒体稳态、自噬流和类似成骨的转分化。随后制备了Lip@ZIF-8(Mfn2/SMART1)并对其物理化学性质进行了表征。通过细胞摄取、溶酶体共定位和CCK-8测定来评估其生物相容性和功能释放效率。在体内实验中，将纳米系统局部注射到椎间盘中，并结合体内成像系统（IVIS）、微计算机断层扫描（micro-CT）、组织学染色、免疫组化（IHC）和分子分析，系统评估Lip@ZIF-8(Mfn2/SMART1)的体内保留和分布特性及其对CEP钙化、线粒体稳态和Smurf1-Mfn2-AMPK-自噬轴的调控作用。

结果

综合蛋白质组学和代谢组学分析显示，在IVDD的CEP组织中，Smurf1显著上调，而Mfn2显著下调，伴随AMPK信号传导受损和线粒体氧化代谢紊乱。动物实验表明，在大鼠CEP钙化模型中，Smurf1的异常激活、Mfn2和AMPK信号传导的抑制以及自噬流的阻断同时发生，导致线粒体结构损伤、类似成骨的转分化增强和病理钙化加剧。机制研究证实Smurf1直接与Mfn2相互作用，作为其上游的E3泛素连接酶，介导Mfn2的泛素化和降解。体外功能测定显示，Smurf1抑制与Mfn2补充联合使用可协同增强AMPK活性并恢复自噬流和线粒体稳态。制备的Lip@ZIF-8(Mfn2/SMART1)表现出良好的物理化学稳定性、酸触发的释放特性和细胞相容性，能够在CEP细胞中有效摄取并在溶酶体中释放。体外和体内实验均证明Lip@ZIF-8(Mfn2/SMART1)同时下调Smurf1、上调Mfn2并激活AMPK-自噬轴，从而显著改善线粒体结构和功能，抑制类似成骨的转分化和CEP的钙化。

结论

Lip@ZIF-8(Mfn2/SMART1)实现了Mfn2 mRNA和SMART1的协同递送，重建了Smurf1-Mfn2-AMPK-自噬调控轴，恢复了线粒体功能，并有效抑制了CEP钙化，为未来的IVDD干预提供了机制基础和候选纳米治疗策略。

图形摘要