《Journal of Animal Science and Biotechnology》：SCAN: a cross-species single-cell transcriptome resource for domestic animals—revealing divergent spermatogenesis in avian and mammalian systems
尽管家畜单细胞转录组数据增长惊人，但其全部潜力因缺乏专门的功能数据库和注释工具而受到严重限制。系统整合、标准化和深度解读家畜单细胞数据的能力仍然非常有限。本研究构建了SCAN，一个高质量资源平台，整合了来自六个家畜物种（Sus scrofa、Gallus gallus、Bos taurus、Bos grunniens、Ovis aries和Oryctolagus cuniculus）以及一个代表性模式生物（Danio rerio）的超过210万个单细胞数据集。该数据集覆盖33种组织类型和155种细胞类型，提供每种细胞的差异基因表达谱。基于该平台，研究人员开发了标准化分析流程和可视化工具，并建立了家畜标记基因库和高质量鸡单细胞注释参考数据集（CARD）。此外，为展示该平台的实用性，研究人员利用SCAN对鸟类和哺乳动物物种之间的精子发生进行了跨物种单细胞比较。分析表明，精子发生的早期阶段在物种间相对保守，而后期阶段差异增大；鸡的精细胞（SPT）和精子在分解代谢相关通路中显著富集。这些观察提示鸡精子发生的晚期可能采用不同于哺乳动物的代谢策略，但其潜在机制仍有待功能实验验证。本研究为家畜单细胞数据提供了一个统一且标准化的资源平台（SCAN），极大地促进了数据获取、细胞注释和下游生物学探索，从而推动下游生物学发现——本研究中所呈现的精子发生研究即为示例。SCAN数据库可在http://www.scanimalsdb.bio-zz.cn免费永久访问。
**研究背景与问题**
单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为高通量转录组分析的强大工具，为研究细胞状态和动力学提供了前所未有的分辨率。与批量RNA测序不同，scRNA-seq能够捕获组织内不同细胞类型之间的异质性，识别稀有但关键的细胞群体，揭示不同细胞状态或发育阶段的基因表达模式，并分析组织内细胞间通讯。随着scRNA-seq技术的广泛应用，其数据质量和数量近年来显著提升。海量公开scRNA-seq数据需要有效的整合与管理，辅以严格的质量控制、数据分析和挖掘，以确保这些数据集的可靠性和可用性。快速获取已发表数据集使研究人员能够更高效地解决科学问题，避免重复劳动并节约宝贵资源。此外，将新生成的数据与已发表数据集进行比较有助于验证研究结果或提出新的生物学假设。公共数据集还可促进跨物种比较，为物种间进化关系提供见解。
目前已有若干与scRNA-seq相关的数据库。例如，人类细胞图谱（HCA）是最大的单细胞数据库，提供了健康人体所有细胞的参考图谱。CellMarker 2.0汇编了人类和小鼠各种细胞类型的实验验证标记基因。PanglaoDB同样收集了人类和小鼠的单细胞转录组数据集。然而，这些数据库主要集中于人类和小鼠物种，明显缺乏与家畜相关的数据集。仅有少数数据库包含极少量家畜数据，如EMBL-EBI的子数据库单细胞表达图谱（SCEA）。尽管SCEA覆盖了更广泛的物种，但其数据量相对有限，且不提供数据分析或图像可视化功能，而是侧重于跨物种基因表达。因此，据研究人员所知，目前尚无专门针对家畜的、提供标准化生物信息学分析和高级可视化功能的scRNA-seq数据库，这极大地限制了该领域的研究。
与此同时，动物模型已成为再生医学不可或缺的工具，不仅帮助科学家加深对再生过程的理解，还促进了新疗法和技术的发展。此外，在研究物种间进化关系的兴趣日益增长以及对高质量畜产品需求增加的推动下，家畜物种研究受到了广泛关注。在生殖生物学领域，scRNA-seq为阐明精子发生——一个高度保守但具有物种特异性的生物学过程——提供了理想方法。精子发生始于精原干细胞，经过有丝分裂增殖、减数分裂和精子形成，最终产生成熟精子。该过程依赖于睾丸内生殖细胞与体细胞之间复杂的相互作用，包括支持细胞（SCs）、肌样细胞和间质细胞。尽管精子发生的核心发育框架在脊椎动物中保守，但鸟类和哺乳动物物种在精子发生周期调控、温度敏感性和关键基因调控网络方面存在显著差异。因此，在单细胞水平上对睾丸组织进行跨物种比较，对于阐明生殖策略的进化适应和指导家畜育种计划具有重要的科学意义。然而，当前缺乏家畜单细胞数据库和标记基因库严重阻碍了此类研究的进展。
为解决这些挑战，研究人员构建了动物单细胞图谱（SCAN），一个整合了六个家畜物种（Sus scrofa、Gallus gallus、Bos taurus、Bos grunniens、Ovis aries和Oryctolagus cuniculus）和一个模式生物物种（Danio rerio）scRNA-seq数据的数据库。它涵盖33种组织，包含2,165,618个细胞（截至2025年12月20日）。除统一的数据管理和访问功能外，SCAN还整合了标准化分析流程、精确的细胞注释流程、交互式可视化界面、细胞类型标记基因查询以及专门为鸡物种开发的单细胞注释参考数据集CARD。在此基础上，作为平台实用性的展示，研究人员利用SCAN系统进行了家畜精子发生的跨物种比较研究，揭示了鸡与哺乳动物之间生殖发育的进化模式，并为不同物种间生殖适应策略提供了新见解。该平台不仅为家畜生殖和发育性状的遗传分析提供了关键数据支持，也为家畜分子育种实践奠定了理论基础。
**关键技术方法**
研究人员从三个公共数据库（主要来自基因表达综合数据库GEO，补充数据来自欧洲核苷酸档案ENA和国家基因组数据中心NGDC）搜索scRNA-seq数据，采用标准化分析流程处理收集的数据集，包括质量控制、批次效应消除、细胞聚类、差异表达分析、细胞类型注释和细胞分类。单细胞数据分析主要使用Seurat包（v5.3.0）。细胞类型注释采用两步策略：首先使用SingleR包（v2.2.0）对所有数据进行注释，根据涉及的组织类型选择celldex包（v1.11.1）中的参考数据集（如HPCA或Blueprint/ENCODE）；其次，若文献提供了细胞类型的标记基因，则根据特定细胞类型标记基因的表达再次注释细胞簇以提高准确性。数据库后端使用Python处理所有数据流，前端使用Bootstrap库构建布局和样式，数据可视化使用ECharts库开发。组织采集方面，从标准条件鸡群中随机选取三只健康公鸡，安乐死后采集睾丸和肝脏组织用于后续研究。跨物种比较分析中，鸡睾丸组织scRNA-seq数据来自研究人员先前发表的数据集（20周龄鸡），使用10X Genomics平台构建单细胞转录组文库，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序。其他物种（猪、牦牛和羊）的睾丸组织scRNA-seq数据从SCAN数据集获取（GSE174782、GSE225618和GSE159599），人类数据来自GEO数据集（GSE12013）。跨物种直系同源基因映射方面，首先将表达矩阵中的基因符号或现有Ensembl ID转换为各物种的Ensembl基因ID，然后利用Ensembl BioMart提供的hsapiens_homolog_ensembl_gene注释将非人类物种的基因统一映射到人类Ensembl直系同源基因ID。差异表达基因使用Seurat包的FindAllMarkers函数以Wilcoxon秩和检验鉴定，过滤阈值为Padj < 0.05、log2|FC| > 0.25和pct.1 > 0.1。GO和KEGG通路富集分析使用R包clusterProfiler（v4.8.3）进行。细胞周期分析使用Seurat内置的细胞周期特征基因集，细胞间通讯分析使用CellChat R包（v2.1.1），拟时序轨迹分析使用Monocle3（v1.3.4）R包。RNA提取和实时定量PCR验证使用TRIzol试剂提取睾丸组织总RNA，以GAPDH基因作为内参，使用2?ΔΔCt方法计算相对基因表达。荧光原位杂交方面，固定睾丸组织石蜡包埋、切片、透化，与荧光标记特异性探针过夜杂交，DAPI复染细胞核后使用Nikon荧光显微镜成像。跨物种批量RNA-seq分析方面，从GEO数据库下载人类、小鼠、猪、牛和鸡肌肉卫星细胞的批量RNA-seq数据集进行跨物种分析。CARD数据集构建方面，从GEO数据库收集各种原代鸡细胞类型的批量RNA-seq数据集，将所有样本的表达值统一转换为TPM格式，整合为标准化的基因表达矩阵，并打包为SummarizedExperiment对象。
**研究结果**
**数据库设计与总体描述**：SCAN作为用户友好的网络服务器，提供单细胞测序数据部署、数据集搜索和数据分析、标记基因搜索以及详细用户手册等综合功能。SCAN数据库包含72个数据集，主要来自六种家畜和一种模式生物（斑马鱼）。“数据”页面汇总了物种、组织、测序技术、发表信息、细胞类型和标记基因等关键信息。数据分析页面涵盖来自72个数据集的2,165,618个细胞，涉及155种细胞类型，涵盖7个物种和33种不同组织。基于处理后数据，研究人员在“数据分析链接”模块中提供标准化可视化结果，大多数结果已根据原始文献（如有）精确注释了细胞类型，用户可直接下载用于后续验证。“标记基因”模块不仅列出文献报道的相关标记基因，还详述其在组织内不同细胞类型中的具体表达模式。
**SCAN统计**：SCAN数据库共包含七个物种，其中数据集数量最多的是Sus scrofa和Gallus gallus，分别为23和24个数据集，合计占总数65%。其次是Danio rerio（11个数据集）、Ovis aries（5个）、Bos grunniens（5个）、Bos taurus（3个）和Oryctolagus cuniculus（1个）。组织/器官分布分析显示，大多数研究集中在胚胎（13个数据集，15%）、视网膜（8个，9%）、肠道（7个，8%）、外周血（6个，7%）、睾丸（6个，7%）和皮肤（6个，7%），其次是心脏（4个，5%）、大脑（3个，3%）、卵巢（3个，3%）和脾脏（3个，3%）。与SCEA数据库比较，SCEA仅包含四个Gallus gallus数据集、一个Ovis aries数据集和两个Oryctolagus cuniculus数据集，而SCAN包含SCEA所没有的Sus scrofa、Bos grunniens和Bos taurus数据集。与SPEED数据库比较，SPEED包含五个物种的数据，SCAN相比SPEED增加了Bos grunniens数据集，且家畜物种的数据集数量显著高于SCEA和SPEED数据库。
**用户友好的数据搜索和单细胞可视化模块**：SCAN数据库提供两种搜索方法：主页按物种分类的快速搜索按钮，允许用户根据感兴趣的物筛选数据集；“数据”页面按六个标准（发表日期、物种、组织、平台、测序技术和参考数据库）筛选数据集。单细胞数据分析可视化页面基于Shiny构建，提供六个模块用于可视化分析结果，并可下载“Seurat对象”和统计图。为确保注释准确性，大多数数据的细胞类型已根据原始文献提供的标记基因或数据标签精确注释。对于原始文献未提供标记基因的数据，研究人员使用SingleR提供的Human Primary Cell Atlas Data（HPCA）或Blueprint/ENCODE数据集进行注释。用户可直观查看细胞类型信息和基因表达分布、探索基因共表达模式、使用小提琴图/箱线图比较样本或细胞簇间的表达差异、检查各细胞类型在样本中的比例分布、使用气泡图/热图分析基因在细胞簇间的表达、通过差异表达模块中的火山图或数据表筛选关键基因。
**标记基因模块**：为填补家畜标记基因总结的空白，研究人员基于对文献的全面人工审查，汇编了不同细胞类型对应的标记基因列表。细胞类型标记列表包括以下列：物种、细胞类型、标记基因、文章标题、数据名称、UMAP和小提琴图。此外，当用户点击基因名称时，会重定向到NCBI网站上该基因的页面；点击文章名称则跳转到PubMed页面。研究人员还绘制了该标记基因在相应数据中的UMAP和小提琴图，使用户能够检查其在不同细胞类型中的表达。
**SCAN的应用——跨物种精子发生分析**：为进一步利用SCAN作为生物学研究的宝贵资源，研究人员对睾丸组织进行了跨物种分析。该分析整合了SCAN中可用的猪、牦牛和羊的数据集与研究人员自己的鸡测序数据以及公开可用的人类数据。经过质量控制和过滤，研究人员获得了五个物种共53,504个高质量细胞的转录组。最终数据集平均每个物种10,701个细胞，每个细胞独特分子标识符（UMIs）中位数为2,140，线粒体UMIs百分比低。研究人员鉴定了所有物种中参与精子发生连续增殖和分化途径的主要生殖细胞类型：精原细胞（SPG）、精母细胞（SPC）、精细胞（SPT）和精子。还表征了睾丸组织的体细胞，特别是支持精子发生的支持细胞（SCs），以及其他细胞类型，包括间质细胞（LCs）、肌样细胞（MCs）、内皮细胞、NK细胞、白细胞和巨噬细胞。利用SCAN数据库的标记基因库进行快速准确的细胞注释。例如，研究人员选择SCAN数据库中的TKTL1和PIWIL1基因分别作为SPG和SPC细胞的标记基因。细胞比例分析显示，四种生殖细胞类型（SPG、SPC、SPT和精子）在鸡和猪中分布相对均匀，生殖细胞占总细胞群体的96%以上。在人类和羊中，生殖细胞约占73%–78%，而在牦牛中，生殖细胞仅占约13%，体细胞高达87%。这些差异可能不仅反映了物种的固有生物学特征，还可能受到原始研究中技术差异的影响，如组织采样策略和解离方案。
此外，研究人员进一步聚焦四种生殖细胞类型并进行了细胞周期分析。结果显示，不同物种的SPC主要处于G2/M期，表明减数分裂（发生在G2/M期）的启动和进展代表精子发生中高度保守的核心事件。相比之下，SPG主要处于S期，与SPG增殖在物种间的普遍作用一致。值得注意的是，人类SPG在S期的比例最高。虽然人类、猪、羊和牦牛的SPT和精子主要处于G1期，但鸡的这两种细胞类型主要处于G2/M期，突出了鸟类精子发生中独特的细胞周期调控。GO功能富集分析显示，SPG和SPC的富集模式在物种间相似，SPT和精子也是如此。具体而言，所有五个物种的SPG和SPC主要富集于核糖核蛋白复合物生物发生和RNA加工等GO术语，牦牛还额外富集于DNA代谢过程等代谢过程。此外，四种哺乳动物的SPT和精子主要富集于生殖细胞发育、精细胞分化和纤毛运动等GO术语，而鸡的SPT和精子主要富集于分解代谢过程等代谢相关GO术语。KEGG富集分析显示，五个物种的SPG和SPC主要富集于核糖体通路和细胞周期通路等，牦牛在DNA复制通路中富集更为显著。SPT和精子主要富集于碳代谢和嘌呤代谢等代谢通路。泛素介导的蛋白水解通路在鸡、人类和猪中有富集，但表现出物种特异性活性模式：在SPT/精子（鸡）、SPG/SPC（人类）以及所有生殖细胞阶段（猪）中富集。
**鸡睾丸细胞与哺乳动物物种相关性最低**：为比较物种间的相似性和差异性，研究人员整合了不同物种的所有细胞。分析显示，四种哺乳动物在SPG中表现出大量重叠，而在SPC中开始分离。值得注意的是，鸡生殖细胞与其他哺乳动物之间未观察到重叠。为进一步研究跨物种不同细胞类型之间的关系，研究人员进行了相关性分析。总体而言，鸡与比较的哺乳动物物种相关性相对较低（r < 0.46）。有趣的是，在睾丸组织中，鸡与人类的相关性仍高于与猪、羊和牦牛的相关性。在细胞水平上，四种鸡生殖细胞（SPG、SPC、SPT和精子）也与其人类对应物显示出相对较高的表达相似性（r < 0.53）。然而，这些相似性并未改变鸡在整体上与哺乳动物进化距离较远的事实（r < 0.53）。此外，跨物种生殖细胞相关性遵循一致模式：SPG中相似性最高（r > 0.46），随着精母细胞分化逐渐降低，精子相关性最低（r > 0.3）。这一模式在UMAP可视化中得到证实，四种哺乳动物的SPG群体大部分重叠，而SPC开始分离。
为鉴定不同物种精子发生过程中的保守基因和物种特异性基因，研究人员整合了各物种生殖细胞类型（SPG、SPC、SPT和精子）之间的差异表达基因，筛选标准为Padj < 0.05、log2|FC| > 0.25和pct.1 > 0.1。结果显示，在鸡、人类、猪、羊和牦牛中分别鉴定出7,012、10,471、6,927、6,336和3,629个差异表达基因。在五个物种中保守的1,545个基因主要富集于核染色体分离和核糖核蛋白复合物生物发生等GO术语，以及核质运输、内质网中蛋白质加工和细胞周期等通路（Padj < 0.05）。此外，物种特异性基因的富集分析显示，鸡主要富集于细胞外基质组织和轴突发育GO术语，以及cAMP信号通路和钙信号通路（Padj < 0.05）；羊主要富集于阿米巴型细胞迁移GO术语和神经活性配体-受体相互作用通路（Padj < 0.05）；人类主要富集于轴突发育GO术语和钙信号通路（Padj < 0.05）；猪主要富集于胰岛素信号通路（Padj < 0.05）；牦牛主要富集于肌动蛋白肌原纤维组装GO术语（Padj < 0.05）。研究人员发现人类和鸡共享许多重叠的GO术语。为进一步揭示跨细胞类型的保守和物种特异性表达模式，研究人员对每种细胞类型的差异表达基因分别进行了维恩图分析，并检查了热图中呈现的表达模式。结果表明，在SPG中，SMC1B和DMRT1基因在五个物种中共享；在SPC中，SYCP2和SPATA22基因在五个物种中共享；在SPT中，TEKT1和TEKT2基因在五个物种中共享；在精子中，KIF2C和SPATA18基因在五个物种中共享（牦牛未检测到精子）。研究人员还鉴定了大量在鸡和哺乳动物之间具有不同表达模式的基因。例如，KPNA4和TRAF3IP1等基因在鸡精子中高表达，而TSSK3和GLUL等基因在哺乳动物精子中显示高表达水平。此外，保守基因的功能富集分析显示阶段特异性关联：SPG基因主要参与核糖体生物发生、核质运输、RNA加工和ncRNA加工；SPC基因富集于核染色体分离；SPT基因富集于纤毛组装；精子基因富集于翻译起始。
鉴于鸡的物种特异性，研究人员进一步对鸡每种细胞类型的差异表达基因进行了单独分析。结果显示ADAMTS17、SPATA22和ENSGALG00000002511在SPC中显著差异表达。其中，ENSGALG00000002511对应人类同源基因SYCP1。鉴于SYCP1作为人类SPC的标记基因，研究人员将其作为荧光原位杂交（FISH）实验的阳性对照。实验结果表明，SPATA22在鸡睾丸组织和SPC细胞中均高表达，ENSGALG00000002511主要在SPC细胞核中表达。相比之下，ADAMTS17虽然在批量睾丸组织中低表达，但在SPC细胞中特异性富集。ADAMTS17在组织水平和细胞水平之间的表达差异进一步强调了单细胞分辨率分析的必要性。
**鸡睾丸组织具有独特的细胞间通讯网络**：为进一步鉴定物种间体细胞-生殖细胞通讯的差异，研究人员进行了细胞间通讯分析。鉴于支持细胞在睾丸组织中的关键支持作用，研究人员重点关注支持细胞与四种生殖细胞之间的细胞通讯（牦牛中未检测到相关信号）。此处，支持细胞被指定为信号发送者（表达配体），生殖细胞被指定为信号接收者（表达受体）。分析结果显示，在鸡中，支持细胞与其他四种生殖细胞表现出强烈而广泛的通讯。其中，CDH信号和胆固醇信号仅在鸡中观察到。在羊中，支持细胞与生殖细胞也表现出强烈通讯，但信号通路数量相对有限，主要集中在CypA信号。相比之下，人类支持细胞与生殖细胞之间的通讯较弱。此外，THBS信号和CADM信号主要在鸡、人类和猪的支持细胞与生殖细胞之间的通讯中检测到。值得注意的是，ADGRL和DHEA信号仅在鸡中独特观察到，有趣的是，两者均与cAMP信号通路相关。研究人员进一步分析了涉及的受体-配体对，发现TENM2-ADGRL2等配体-受体对存在于支持细胞向SPC发送的信号中，而DHEA-STS-PPARA存在于支持细胞向SPG、SPT和精子发送的信号中。
**人类和猪精子发生的分歧发生在精母细胞阶段**：为阐明这些物种在精子发生过程中的分歧点，研究人员对跨物种整合数据进行了轨迹分析。结果显示，以SPG为起点，重叠轨迹主要由人类和猪细胞组成，而其他物种的细胞较为分散。因此，研究人员重点分析了解读人类和猪的分化驱动因素。研究结果表明，人类和猪的SPG表现出高度重叠的分布，表明早期发育阶段的保守性。然而，显著分歧始于SPC阶段，最终形成两个主要分支：分支1主要由猪细胞组成，分支2主要由人类细胞组成。为研究这一分歧背后的驱动机制，研究人员进一步鉴定了沿两个分支表达变化的基因。发现两个基因簇共同促进这一分化过程：507个基因沿分支1上调、沿分支2下调，主要富集于细胞内运输相关GO术语和mRNA监控通路，包括KIF23等基因。相反，251个基因沿分支2上调、沿分支1下调，主要富集于细胞器组织和核质运输通路相关GO术语，包括SUN1等基因。这些驱动人类和猪之间分歧的关键基因簇在精母细胞阶段被鉴定，为精子发生过程中的种间差异提供了分子层面的见解。
**跨物种批量RNA-seq分析揭示鸡与哺乳动物之间的显著差异**：基于上述分析结果，研究人员观察到鸡与其他哺乳动物物种之间的基因表达谱存在显著差异。这一观察表明，使用基于哺乳动物数据开发的单细胞注释工具来鉴定鸡细胞类型可能不够准确，突出了建立针对鸡的物种特异性注释参考数据集的必要性。由于构建此类参考数据集通常需要原代细胞的批量RNA-seq数据作为基础，研究人员首先验证并进一步确认了鸡和哺乳动物在原代肌肉卫星细胞中的显著分子差异。具体而言，研究人员对来自人类、小鼠、猪、牛和鸡的批量RNA-seq数据进行了整合分析，所有这些数据均来自GEO数据库。聚类分析和主成分分析一致显示，鸡卫星细胞与其他哺乳动物物种显著不同，进一步强调了开发鸡物种特异性参考数据集的必要性。
**鸡细胞注释参考数据集（CARD）的构建与验证**：基于这些发现，研究人员建立了首个鸡原代细胞注释参考数据集——CARD。该数据库整合了90个样本的RNA-seq数据，涵盖12种主要类型和31种亚型的原代鸡细胞。转录组分析显示同一细胞类型之间高度一致，已知标记基因表现出细胞类型特异性高表达模式。这些结果共同支持了参考数据库的可靠性和准确性。为评估CARD的实用性，研究人员将其应用于注释两个公开可用的鸡单细胞RNA-seq数据集（GSE251682和CRA002353）。根据GSE251682数据的人工注释，共鉴定出11种细胞类型，每种细胞类型对应的标记基因也高表达。然而，使用HPCA进行注释，发现仅一种内皮细胞与人工注释的细胞类型对应。接下来，使用研究人员构建的CARD进行注释，发现红细胞、免疫细胞、间充质细胞和成肌细胞等共4种细胞类型与人工注释结果对应。在另一个CRA002353数据集中也发现了相同结果，人工注释共8种细胞类型。使用HPCA注释，发现目前没有与人工注释结果对应的细胞类型。然而，使用CARD注释，发现免疫细胞、成肌细胞、色素细胞和间充质细胞四种细胞类型可以与人工注释结果对应。为系统评估CARD和HPCA参考数据集在细胞类型注释中的准确性，研究人员利用公共scRNA-seq数据集（CRA002353和GSE251682）计算各参考数据集的注释结果与人工注释之间的Accuracy和Kappa指标。CARD数据集的注释结果显示Accuracy值大于0.54，Kappa值超过0.39，而HPCA数据集的Accuracy小于0.12，Kappa值低于0.07，表明CARD实现了更高的注释准确性，证实了物种特异性参考数据在单细胞注释中的重要性。此外，为系统评估CARD在鸡单细胞转录组数据上的注释性能，本研究使用两个公共数据集CRA002353和GSE251682进行了多维验证分析。首先，细胞类型特异性标记基因的气泡图显示，CARD注释的每种细胞类型均特异性高表达其对应的经典标记基因，表明注释结果具有良好的生物学合理性。进一步，研究人员将代表性标记基因映射到UMAP降维空间，结果显示这些基因高表达的细胞主要集中于相应的细胞簇内，其空间分布与CARD注释的细胞类型高度一致，从聚类结构和基因表达特征两方面共同支持了注释结果的可靠性。此外，CARD注释结果与人工注释之间的桑基图比较显示，两个数据集中绝大多数细胞均映射到具有相同或高度相似生物学特性的细胞类型，表明两种注释方法之间具有清晰的对应性和高度整体一致性。总之，基于气泡图、UMAP空间分布和桑基图的验证证据，CARD能够稳健地识别两个数据集中的主要细胞类型，表现出强大的泛化能力和实用价值。
**讨论与结论**
本研究通过建立SCAN——一个大规模家畜单细胞数据库——做出了重要贡献。该平台系统整合了大量家畜单细胞转录组数据，提供了一套家畜特异性标记基因，并包含针对鸡优化的自定义注释工具，从而填补了家畜单细胞数据资源的关键空白。SCAN包含数百万个细胞。与SCEA和SPEED等现有资源相比，SCAN在家畜物种覆盖和数据整合深度方面具有显著优势。此外，该平台的一个关键创新是构建了CARD数据库，专门针对鸡等非哺乳动物家畜设计，其转录组与哺乳动物显著不同。这一设计有效解决了当前注释工具（如SingleR）主要依赖人类和小鼠参考数据集的局限性。同时，SCAN整合了来自6个家畜物种和1个模式生物（斑马鱼）的超过616个文献验证的物种特异性细胞标记基因，有效填补了主流数据库（如CellMarker）中家畜数据的空白。这些资源共同构成了家畜单细胞数据的综合基础，显著提高了家畜细胞注释的准确性，并为深入的跨物种比较和发育研究提供了关键支持。
基于SCAN平台，研究人员首次在单细胞分辨率上比较了鸟类（鸡）和哺乳动物物种之间的精子发生调控网络。该分析揭示了进化上保守的框架和显著的物种特异性差异。研究结果表明，脊椎动物精子发生的核心调控框架在进化上高度保守。早期生殖细胞（精原细胞和精母细胞）在物种间表现出相似的生物学特性，功能主要富集于核糖核蛋白复合物生物发生和RNA加工等基本细胞过程。这些机制对于维持减数分裂的保真性至关重要。然而，随着分化进展到后期阶段（精细胞和成熟精子），种间差异大幅增加，呈现出“早期保守、后期分歧”的转录组变化模式。这一模式与进化发育生物学的观点一致，即早期发育阶段受到更强的功能约束，而后期阶段更容易受到物种特异性适应压力的影响。具体而言，晚期生殖细胞的种间差异表现为功能策略的分歧：哺乳动物显著富集于精子发育和纤毛运动相关通路，而鸡在分解代谢过程中强烈富集。这一差异提示鸡精子可能更依赖代谢能量稳态而非强烈的自主运动，可能与其在雌性生殖道中的存活有关；然而，这仍是一个假设，这些观察为进一步探索跨物种精子存活策略的代谢调控机制提供了初步线索。
值得注意的是，鸡特异性表达基因显著富集于cAMP信号通路。在哺乳动物中，cAMP经典地被认为是启动精子运动的关键触发因素。然而，鉴于鸡精子不依赖强烈的自主运动，这种富集提示cAMP通路可能在鸟类生殖系统中具有额外或替代功能，如参与代谢调控或受精准备。在细胞相互作用水平上，研究人员观察到鸡睾丸组织中支持细胞与生殖细胞（特别是与早期生殖细胞）之间存在广泛且独特活跃的通讯网络，并检测到仅在鸡中活跃的ADGRL和DHEA信号通路，两者均与cAMP通路相关。先前研究也表明cAMP通路参与鸡支持细胞的成熟和功能调控。综上所述，这些观察提示cAMP信号可能在鸡精子发生中发挥更广泛的协调作用，尽管需要进一步直接证据来阐明这一可能性。
此外，跨物种轨迹分析揭示了不同哺乳动物物种在精子发生后期的进一步分化。例如，在SPC阶段，猪和人类分别主要聚焦于mRNA监控通路和核质运输通路。这一差异可能反映了它们在SPC形成阶段的不同适应需求：猪倾向于维持快速增殖和更新的细胞状态，而人类更注重建立稳定的转录程序以确保遗传信息的精确性。
尽管SCAN为跨物种比较提供了有用的资源，但应承认若干局限性。首先，SCAN整合了来自不同实验室、测序平台和组织解离方案的数据，因此数据集之间可能存在技术和采样偏差。其次，细胞类型注释依赖于现有标记基因和参考数据集，对参考数据中未包含的稀有细胞类型或组织的注释能力仍然有限。第三，尽管CARD在两个公共数据集上优于HPCA，但其细胞类型和样本来源的覆盖范围仍然有限。最后，数据库的更新和维护依赖于持续的数据收集和人工管理；随着新数据的添加，标记基因和注释结果可能需要进一步修订。
总之，本研究构建了SCAN——一个适用于多种家畜物种的单细胞数据平台，整合了丰富的多组织、多细胞类型数据和系统注释工具。以精子发生为例，研究人员利用SCAN鉴定了鸡和哺乳动物晚期精子发生之间的转录组差异。这些观察提示鸡可能具有独特的代谢策略，但仍需功能验证。这展示了SCAN在非模式物种研究中的实用性。未来，SCAN平台将聚焦三个关键领域。第一，研究人员将定期整合新的家畜单细胞数据集，扩大物种和组织覆盖范围。第二，研究人员将整合多组学数据，包括ATAC-seq和空间转录组学，构建用于细胞分型、谱系追踪和微环境分析的多模态框架。第三，基于鸡参考数据，研究人员将开发针对非模式家畜的物种特异性注释工具，以减少来自人类和小鼠数据的注释偏差。SCAN数据可免费用于非商业学术用途，需注明来源；商业使用需获得通讯作者许可。
