基于无扩增纳米孔宏基因组测序检测莱姆神经疏螺旋体病患者血浆中疏螺旋体特异性游离DNA的探索性研究

《European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases》：Borrelia-specific cell-free DNA in plasma from adults with Lyme neuroborreliosis: an explorative study

当前针对莱姆神经疏螺旋体病（LNB）的血液学诊断方法存在显著局限性。研究人员采用下一代测序技术，对LNB患者及非LNB对照者的血液样本中鲍氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）特异性游离DNA（Bb-cfDNA）进行了检测。研究纳入61例疑似LNB成人患者的血液样本，采用无扩增纳米孔宏基因组测序（amplification-free Nanopore metagenomic sequencing）进行分析，并将检出的cfDNA与人类基因组及Bb基因组数据库进行交叉比对以鉴定Bb特异性cfDNA。结果显示，45例LNB患者中3例（6.7%）检出Bb-cfDNA，16例对照者中无一检出。阳性样本中疏螺旋体分类读数（reads）水平较低。研究表明，Bb-cfDNA不大可能成为免疫健全成人LNB的 relevant 血液学诊断检测方法。

莱姆神经疏螺旋体病（Lyme neuroborreliosis, LNB）是由鲍氏疏螺旋体广义种复合体（Borrelia burgdorferi sensu lato, Bb s.l.）中的螺旋体侵犯神经系统所致的感染，在流行国家年发病率约为1–9/10万，是最常见的细菌性神经系统感染之一。目前血清学检测是唯一可用的血液学诊断工具，但特异性抗体水平需数周才能达到可检测水平，且可持续数年，在流行区难以区分急性感染与既往感染。血液PCR和培养尽管经过多番样本处理和检测方法的优化，阳性率仍极低。近年一项研究中非靶向蛋白质组学灵敏度看似可观，但缺乏测序技术所能提供的菌种鉴定信息。游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）是体液中自由循环的小片段DNA，通常来源于人体细胞衰老或急性损伤后的持续降解。然而在感染过程中，即使病原体来源的cfDNA水平极低，也可从血液或其他体液中提取并检测，用于鉴定急性感染的微生物学病因。因此，微生物cfDNA测序提供了一种不依赖培养的病原体检测方法。本探索性研究旨在评估纳米孔宏基因组测序能否从LNB患者血浆中检出Bb特异性cfDNA，从而判断其作为未来诊断工具的潜力。研究人员于2023年6月至2025年11月从丹麦首都大区神经内科和感染科前瞻性纳入疑似LNB患者，依据欧洲神经病学联盟（EFNS）诊断标准将患者诊断为可能或确诊LNB。血液样本在诊断性腰椎穿刺时直接采集于DNA稳定管中以最大程度保存cfDNA。所有实验室流程详见protocols.io。简言之，从血浆中提取cfDNA并于-80℃保存至批量分析，每批提取均设阴性水对照。测序文库采用优化的Native Barcoding Protocol制备，在PromethION 2 Solo（Oxford Nanopore Technologies）上使用Promethion flow-cell（FLO-PRO114M）以Super Accuracy Basecalling模式在MinKnow v.25.09.16中测序72小时。读数通过GitHub自定义流程处理：保留最低Phred评分10、长度≥50 bp的读数；采用两种独立方法鉴定候选疏螺旋体读数——针对Standard数据库的Kraken 2分类器及比对至Genome Taxonomy Database中目水平分类为Borreliales的手工 curated 基因组数据库；所有候选读数进一步比对人类参考基因组和RefSeq数据库进行验证。候选读数须经Kraken 2和比对两种方法均阳性鉴定，且BLAST比对至人类基因组或RefSeq中非疏螺旋体物种无更优匹配，方计为疏螺旋体阳性。研究共分析61例疑似LNB患者的血液样本，包括45例LNB患者（确诊38例，可能7例）和16例非LNB对照。非LNB组包括游走性红斑、慢性萎缩性肢皮炎、病毒性脑膜炎、脑膜癌病及未确立最终诊断的患者。Bb-cfDNA在3/45（6.7%）LNB患者中检出，非LNB对照0/16（0%）检出。所有可检出Bb-cfDNA的患者均为免疫健全男性，无显著合并症；3例中2例有游走性红斑病史，2例报告典型神经根性疼痛，2例表现为面神经麻痹。Bb-cfDNA阳性LNB患者在年龄、症状持续时间、采样前抗生素治疗、脑脊液白细胞计数或脑脊液蛋白水平方面与Bb-cfDNA阴性LNB患者无显著差异。3例中2例在采血前接受过抗生素治疗（多西环素100 mg每日两次，分别用1天和21天）。45例LNB患者中31例（69%）在采样前接受抗生素治疗（青霉素2/31（6%）、多西环素12/31（39%）、青霉素后续多西环素11/31（35%）、头孢曲松6/31（19%）），中位疗程4天（IQR：2–10，最短1天，最长22天）。阳性样本均在不同批次中测序。读数过滤后平均读长235 bp，平均质量Phred评分19.6，平均每样本1410万条读数。样本ID 1、15和39分别有1、3和2条疏螺旋体鉴定读数，分别占总读数的0.00002%（1/4,434,094）、0.00001%（3/16,847,709）和0.00002%（2/9,558,926）。Bb-cfDNA分类读数为短片段（59–253 bp）。样本1和39的读数均与Borrelia bavariensis匹配，与RefSeq序列错配0–1 bp；样本15的3条阳性读数（59、77和146 bp）分别最佳匹配Bb s.l.、Borrelia garinii和Borrelia valaisiana，与RefSeq序列错配分别为3、0和15 bp。本探索性研究在3/45例LNB成人患者血浆中检出Bb-cfDNA，对照者无一检出。这是首项针对欧洲LNB患者研究Bb-cfDNA的工作，既往研究Bb-cfDNA的报道涉及北美不同表现莱姆病（LB）患者。2020年Branda等使用商业平台（Karius Inc.）在19/40（48%）游走性红斑患者血液中检出Bb-cfDNA，684例健康对照均未检出。Handel等使用同一平台对15例儿童LB患者样本测序（每样本2000–2500万条读数），其中11例初始阴性；以平均每样本3.41亿条读数深度重测序后，11例中3例转为阳性，支持超深度测序的必要性。这两项美国研究报道的产量显著更高，最可能源于研究人群差异——Branda和Handel等主要纳入急性皮肤LB患者，该群体常规直接病原鉴定方法的阳性率已知高于LNB患者。尽管在皮肤LB美国患者中表现优越，Bb-cfDNA血液检测诊断任何LB表现的灵敏度从临床角度看仍相当低。若干技术因素可能限制了本研究的灵敏度：无扩增纳米孔宏基因组测序可对全长天然cfDNA片段进行实时测序，适合小批量样本，但该平台通量较Illumina或Ultima Genomics等可进行大批量超深度测序的仪器仍有不足。本队列中部分患者可能携带低于检测阈值的Bb-cfDNA，在更高测序深度下可判为阳性；此外，流程中严格的多因素确认策略也可能降低灵敏度。既往研究显示，通过选择较短cfDNA片段并使用单链文库制备可实现mcfDNA富集。除绝对病原负荷低和宿主DNA背景压倒性外，采样时机与抗生素启用时间的关系亦需考虑：LNB组中位症状持续时间34天，提示从感染到采样间隔较长，可能降低血液中细菌负荷；此外45例LNB患者中31例（69%）在采样前至少1天已接受抗生素治疗，既往研究已证实抗生素治疗后循环mcfDNA显著下降。然而，单纯预处理不太可能完全解释本研究的低检出率，因3例Bb-cfDNA阳性患者中2例采样前亦接受过多西环素。低产量也可能反映LNB的病理生理——感染主要局限于神经系统，循环病原负荷极小，因此免疫健全LNB患者血液培养和PCR阳性率通常极低（分别约1–4%和12%）。需注意，本研究旨在评估血液cfDNA诊断LNB的潜力，故将无神经系统播散征象的皮肤LB表现患者归为对照，因此诊断准确性估计特指检测识别LNB的能力，而非检测任何疏螺旋体感染的能力。尽管存在上述局限，本研究具有前瞻性采样、临床特征明确的研究人群及先进天然DNA测序和严谨数据分析等优势。Bb-cfDNA仅在小部分LNB患者血浆中可检出。尽管在抗生素未治疗患者中更早采样结合超深度测序可能提高检出率，但血液Bb-cfDNA分析不大可能成为免疫健全成人LNB的临床相关诊断检测。鉴于其高特异性，Bb-cfDNA或可作为免疫抑制患者脑脊液PCR的替代确认检测，尤其适用于因B细胞耗竭治疗导致血清学结果不可靠的患者。尽管多属学术兴趣，物种水平鉴定是该宏基因组诊断方法非常有价值的优势，但因疏螺旋体分类读数数量少，须谨慎解读——两个样本匹配丹麦常见疏螺旋体物种，第三个可能反映数据库相关误分类。